Identificación de nuevas proteínas de membrana externa implicadas en la resistencia a antimicrobianos en Klebsiella pneumoniae

proteínas de membrana externa implicadas en la resistencia a antimicrobianos

en Klebsiella pneumoniae.

Laura García Sureda

Tesis Doctoral 2011

UNIVERSITAT DE LES ILLES BALEARS

Identificación de nuevas proteínas de membrana externa implicadas en la

resistencia a antimicrobianos en Klebsiella pneumoniae

Tesis Doctoral

Laura García Sureda

Diciembre 2011

Tesis Doctoral dirigida por el Dr. Sebastián Albertí Serrano.

Área de Microbiología. Departamento de Biología.

Universitat de les Illes Balears

A la meva família, que passi el que passi sempre està a prop.

A ^GRAÏMENTS .

La vida és un llarg camí a recórrer, amb diferents etapes i en el que anam creixent i evolucionant.  Amb  aquesta  tesis  s’acaba  una  d’aquestes  etapes  per  donar-ne peu a una altra, de  moment  plena  d’incerteses,  però plena  d’esperança  i  ganes  de  seguir  endavant,  descobrint,   poc a poc, el que ens ofereix la vida.

Els meus inicis dins el món de la investigació foren fa uns set anys. Tot va començar amb una beca de col·laboració amb el Dr. Sebastià Albertí Serrano, després vaig tenir una beca de la Fundació Mateu Orfila, i posteriorment una   beca   FPI   que   m’ha   permés   realitzar   aquest   doctorat. Aquests   anys   d’investigació,   primer   a   Son   Dureta   i   posteriorment   a   la   UIB, han suposat molts de canvis a la meva vida, a més d’anar   aprenent   com   funciona el món de la investigació i tot el necessari per fer-hi feina, he crescut com ha persona  i  m’he  anat  formant   en altres aspectes tant personals com professionals. Durant aquests anys són moltes les persones  amb  les  que  m’he   creuat a la vida, algunes encara són a prop i esper que hi restin molta estona més,  però  d’altres  han  seguit  el  seu  camí  deixant,  a  vegades  sense  adonar-se’n, una important petjada en mi. Per tot això aprofito aquesta oportunitat per agrair a tots ells el que han fet per mi.

En primer terme voldria agrair   al  Dr.   Sebastià   Albertí   Serrano   l’oportunitat   que   em  va   donar   entrar a formar part del seu grup de recerca i així conèixer el món de la investigació. Agrair-li la seva paciència per ensenyar-me tantes i tantes coses dins i fora del laboratori, per no tenir peresa de posar-se la bata i donar un cop de mà si era necessari, per intentar sempre trobar la millor   manera   d’enfocar   i   fer   els   experiments, i sobretot, per la seva ajuda i ànims durant aquesta tesis. Gràcies pel teu suport i confiança.

Són moltes les persones que durant aquests anys han format part del nostre grup d’investigació,  de  fet  avui  en  dia  ja  no  hi  queda  ningú  d’aquelles  amb  les  que  ferem  la  mudança   des del laboratori de Son Dureta al de la UIB. Tot i això, vull agrair a na Maria Antònia Oliver, a na  Marta  Franco  i  a  na  Mercedes  Urdiain  tot  el  que  m’ensenyaren  quan  vaig  arribar,  les  hores,   rialles i mal de caps compartits entre pipetes i bacteris. A n’Enma Padilla, en David Moranta i n’Ivan  López els bons moments que compartirem dins el laboratori. Però, sense cap dubte, les persones amb qui més temps he estat fent feina i investigant han estat na Mariette Barbier i n’Inmaculada  Martínez Ramos. Mariette, arribats en aquest punt no tenc cap dubte que tot el que hem compartit, dins i fora del la UIB, ha estat important per assolir aquest moment. A més

d’aprendre  tècniques d’investigació, a utilitzar programes informàtics, compartir viatges i congressos, la teva ajuda i amistat han fet que creixés com a persona. Inma, la teva arribada fa uns anys va  suposar  una  recàrrega  d’alegria  i  d’energia  positiva.  Aquests  anys  hem  compartit   moltes coses, són moltes les vegades que ens hem rellevat en els experiments o que hem compartit esperes. També són moltes les vegades que hem anat a ballar o hem sortit de festa plegades. Es sorprenent com ets capaç de portar sempre un somriure dibuixat i transmetre alegria i ànims als altres. No canviïs i gràcies per la teva amistat i alegria.

A més, vull donar les gràcies a  tots   i  cada  un  dels  membres  de   l’àrea   de   microbiologia  de   la   UIB. Són molts els moments que hem compartit tant en el departament de microbiologia com en seminaris, berenars, etc. i més de dues i tres les vegades que he vengut a fer “d’okupa” al vostre laboratori, a emprar aparells o que us he fet consultes de protocols. Gràcies a tots i a totes.

També vull manifestar el meu agraïment al Dr. Antonio Oliver, al Dr. Carlos Juan, al Dr. Tomeu Moyà i al Dr. Antonio Domenéch-Sanchez per la seva ajuda i col·laboració tant en la part experimental com discutint resultats. Així com al Dr. Vivancos i a tots els membres del seu grup,  que  m’acolliren  a  la  Universitat  Complutense  de  Madrid  i  m’ensenyaren  les  tècniques  de   proteòmica bidimensional.

Per una altra banda no em  puc  oblidar  de  tota  la  gent  que  està  per  l’edifici  cientificotècnic i que han fet que el dia a dia fos més entretingut i més bo de dur. Gràcies a na Marga, n’Antònia, en Guillem, na Marta, na Marina, na Joana, na Mar, na Maria, en Manu, na Trinitat, na Maribel i   en   Juanmi   per   tot   el   que   hem   compartit   tant   a   l’hora   de   dinar com pels passadissos. En especial a na Trinitat per la seva ajuda amb les seqüències de ADN i a na Marta i na Joana pels seus consells, sobretot aquests darrers mesos. No  m’oblido  tampoc de tots els altres,  tant  la  gent  d’administració  (na  Magdalena,  n’Antònia, na Jeroni i en Jesús), com d’en   Fernando i na Maria de consergeria o  els  tècnics  de  l’edifici (en Toni, en Raúl, en Jose, na Rosa, i na Teresa) sense tots voltros el dia a dia no hagués estat el mateix.

Ja fora del món del la investigació no puc oblidar els meus amics Gerardo, Natalie, Jesús, Alfonso, Xisca, Milton i Bàrbara. Són molts els anys que fa que ens coneixem, amb alguns més de 15, i moltes les estones  que  m’heu  sentit  parlar  de  tesis  i  d’experiments, gràcies per tots els moments que hem compartit i pels ànims els dies que les coses no sortien bé.

A les amigues de la carrera de Biologia i  als  seus  al·∙lots  (n’Aina,  n’Alicia,  na  Bàrbara, na Joana C., na Joana F., na Juanamari, na Marga, na Yolanda, en Martí, en Biel, en Victor, en Juanma, en Miquel i en Joan) també els vull agrair el haver estat a prop   durant   el   transcurs   d’aquesta   etapa. Hem compartit moltes coses plegats, i encara en queden moltes per compartir.

Sobretot vull donar les gràcies a na Joana C., en Juanma i a na Marga, trobaré a faltar els berenars i dinars quan feim la xerradeta sobre la vida, les seves ventures i desventures. I de la part de Bioquímica agraïr-li a na Maria Servera la seva  amistat  i  els  moments  “Kinder  Bueno”

que sempre han ajudat a agafar forces.

Gràcies també als amics de Sa Tropa,  en  especial  a  na  Cris,  n’Elisa,  n’Olivia,  n’Andrea  i  na  Cata,   per totes ses estones de festa, sopars, les excursions i els moments de desconnexió que ajuden a recarregar piles quan fa falta. Gràcies per ser com sou.

I en darrer terme, i no per això els menys importants vull donar les gràcies a la meva família, a tots ells, des dels padrins i abuelos a tots als meus tios/ties i cosins/es, que molts de cops heu escoltat ses meves aventures per la UIB o amb els meus “bitxos”, sense saber exactament en que consistia tot això. Però sobretot vull donar-los les gràcies als meus pares Catalina i Toni, a la meva germana Irene, al meu cunyat Jose, i al meu fillol Pau i la meva neboda Neus. Són els que més han patit durant aquests anys els dies que les coses no sortien bé, els canvis d’ànims, el haver de pujar a la UIB els caps de setmana i no poder passar més temps amb ells. Són els que amb el seu suport, paciència i consells fan que qualsevol cosa sigui possible. Sabeu lo molt que us estim, i sense voltros no seria el que soc. Gràcies per estar sempre al meu costat.

Laura García Sureda

Í ^NDICE

A

Í

A

1. I

1.1 Klebsiella como patógeno ... 15

1.1.1 Importancia clínica de K. pneumoniae ... 16

1.1.2 Factores de virulencia de K. pneumoniae ... 18

1.1.3 Mecanismos de resistencia a los antimicrobianos en K. pneumoniae ... 25

1.1.3.1 Enzimas inactivadores de antibióticos: las β-lactamasas ... 25

1.1.3.2 Expulsión activa ... 35

1.1.3.3 Alteraciones de la permeabilidad ... 37

1.2 La membrana externa de las bacterias Gram negativas ... 39

1.2.1 Proteínas de membrana externa ... 40

1.2.1.1 Porinas en K. pneumoniae ... 42

1.2.1.1.1 OmpK35 y OmpK36 ... 42

1.2.1.1.2 OmpA ... 51

1.2.1.1.3 OmpK37 ... 55

1.2.1.1.4 PhoE ... 56

1.2.1.1.5 LamB ... 59

1.2.1.1.6 La familia de las porinas KdgM ... 62

2. H

O

3. M

3.1 Bacterias ... 73

3.2 Medios y condiciones de cultivo ... 74

3.3 Plásmidos ... 74

3.4 Estudios de sensibilidad ... 75

3.4.1 Agentes antimicrobianos ... 75

3.4.2 Concentración mínima inhibitoria ... 75

3.5 Métodos de análisis y purificación de proteínas ... 76

3.5.1 Aislamiento de proteínas de membrana externa ... 76

3.5.2 Purificación de la porina OmpK36 ... 77

3.5.3 Determinación de la concentración de proteínas ... 77

3.5.4 Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) ... 77

3.5.5 Identificación de proteínas ... 78

3.5.6 Identificación de proteínas con anticuerpos ... 78

Obtención de antisuero ... 78

Western blot o transferencia Western ... 79

3.6 Métodos de purificación, manipulación y análisis de ácidos nucleicos ... 79

3.6.1 Purificación de ADN ... 79

3.6.2 Purificación de ARN... 80

3.6.3 Electroforesis en geles de agarosa ... 80

3.6.4 Southern blot o transferencia Southern ... 80

3.6.5 Introducción de ADN plasmídico ... 81

3.6.6 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)... 82

3.6.7 RT-PCR ... 83

3.6.8 Secuenciación ... 84

3.6.9 Construcción de mutantes delecionados mediante inserción-duplicación 84 3.7 Otros métodos ... 86

3.7.1 Curvas de crecimiento y cálculo del tiempo de duplicación ... 86

3.7.2 Experimentos de frecuencia de mutación ... 86

3.7.3 Experimentos de competición in vitro ... 87

3.7.4 Estudios de virulencia en un modelo de infección sistémica en ratón ... 88

4. R

4.1 Efectos de diferentes β-lactámicos sobre la frecuencia de aparición y selección de mutantes en K. pneumoniae. ... 93

4.2 Papel de LamB en la resistencia a antimicrobianos ... 100

4.3 Papel de OmpK26 en la resistencia a antimicrobianos. ... 106

Identificación de OmpK26 ... 106

El papel de OmpK26 en la resistencia antimicrobiana ... 109

Coste biológico de la deficiencia en porinas de K. pneumoniae expresando OmpK26 ... 111

5. C

6. C

7. R

8. A

Recetas ... 149

Secuencia de OmpK26 ... 155

Artículos ... 157

A BREVIATURAS U ^TILIZADAS

ADN ... Ácido desoxiribonucléico AMK ... Amikacina

AMP ... Ampicilina

AMPc ... Adenosín monofosfato cíclico APS ... Persulfato amónico

ARN ... Ácido ribonucléico ARNm ... ARN mensajero ARNr ... ARN ribosómico ARNt ... ARN de transferencia ATP ... Adenosín trifosfato AZT ... Aztreonam

BLEA ... β-lactamasa de amplio espectro

BSA ... Albúmina bovina sérica (bovine serum albumine) CA ... Ácido clavulánico

CAZ ... Ceftazidima CEF ... Cefalotina CIP... Ciprofloxacino CIT ... Cefotetan

CLSI ... Clinical and Laboratory Standards Institute CMI ... Concentración mínima inhibitoria

CPS ... Cápsula

csp ... cantidad suficiente para CTX ... Cefotaxima

CHL ... Cloranfenicol D.O. ... Densidad óptica

EDTA ... Ácido etileno-diamino-tetra-acético

ELISA ... Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzima ETP ... Ertapenem

FEP ... Cefepime FOX ... Cefoxitina GEN ... Gentamicina H2Od ... Agua destilada IC ... Índice de competición IMP ... Imipenem

KAN ... Kanamicina LB ... Luria- Bertani LPS ... Lipopolisacárido LVX ... Levofloxacino MDR ... Multi Drug Resistant ME ... Membrana externa MEN ... Meropenem

MH II ... Mueller Hinton II NAL ... Ácido nalidíxico

NCCLS ... National Committee for Clinical Laboratory Standards pb... Pares de bases

PBP ... Proteína fijadora de penicilina (penicillin binding protein) PBS ... Tampón fosfato salino (phosphate buffered saline) PDB ... Base de datos de proteínas (Protein Data Base)

PCR ... Reacción en cadena de la polimerasa (polimerase chain reaction) PIP ... Piperacilina

PIR ... Cefpirome

PME ... Proteínas de membrana externa RIF ... Rifampicina

RT-PCR ... Reverse transcription–PCR (PCR de transcripción reversa) SDS ... Dodecilsulfato sódico

SDS-PAGE.... Electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico TAE... Tris acético EDTA

TEMED ... N,N,N´,N´-tetrametil-etilendiamina TET ... Tetraciclina

TOB ... Tobramicina TZB ... Tazobactam

UCI ... Unidad de cuidados intensivos UFC ... Unidades formadoras de colonias

Las abreviaturas de los aminoácidos y los nucleótidos se han utilizado siguiendo el código IUPAC.

1. I NTRODUCCIÓN .

1.1 Klebsiella como patógeno.

Klebsiella es un género de bacterias Gram negativas pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, que se caracteriza por ser bacilos anaeróbicos facultativos no flagelados.

Este género está extendido de manera ubicua en la naturaleza y está asociado a gran variedad de hábitats. Klebsiella se encuentra en aguas, suelo, superficies húmedas, vertidos industriales y en la vegetación [1]. Además también es un microorganismo residente o transitorio de la flora (principalmente de la flora del tracto gastrointestinal). Su importancia clínica se debe a que Klebsiella es un patógeno oportunista para los humanos y otros animales.

Durante mucho tiempo, casi todos los aislamientos de Klebsiella se identificaron como una sola especie, K. pneumoniae. Sin embargo, en la década de los 80 estudios fenotípicos y genotípicos demostraron que estos aislamientos correspondían a cinco especies diferentes [2], diferenciables mediante pruebas bioquímicas (Tabla 1.1): K. pneumoniae (con tres subespecies: pneumoniae, ozaenae y rhinoscleromatis), K. oxytoca, K. terrigena, K.

ornithinolytica, y K. planticola. Recientemente, los estudios filogenéticos basados en la comparación de los genes rrs, rpoB [3], gyrA y parC [4], han modificado esta clasificación. De hecho K. planticola, K. terrígena y K. ornithinolytica se han transferido a un nuevo género, Raoutella [3]. Por otra parte, Calymmatobacterium granulomatis, se ha visto que está estrechamente relacionado con K. pneumoniae mediante comparación de las secuencias de rrs (gen 16S rRNA), y es por ello que fue transferido al género Klebsiella como Klebsiella granulomatis [5, 6]. Sin embargo no se sabe si K. granulomatis es una especie distinta a K.

pneumoniae.

Figura 1.1. A. Imagen de Klebsiella pneumoniae crecida sobre agar Mueller Hinton. B. Imagen coloreada de K. pneumoniae al microscopio electrónico de barrido.

La especie de mayor relevancia clínica es K. pneumoniae y, en mucho menor grado K. oxytoca.

A finales del siglo XX también se detectaron aislamientos clínicos pertenecientes a K. terrigena y K. planticola, especies originalmente consideradas sin relevancia clínica y restringidas a los ambientes acuáticos, a la vegetación y al suelo [2, 7-9]. De hecho, en determinados estudios K.

planticola representaba más del 20% de los aislados clínicos de Klebsiella, mientras que K.

terrigena se encontraba ocasionalmente y sólo representaba el 0,4% de los aislados de Klebsiella [9, 10]. Cabe comentar que actualmente las especies K. terrígena, K. planticola y K.

ornithinolytica se han reclasificado en el género Raoultella.

Tabla 1.1. Reacciones bioquímicas de las especies de Klebsiella^a.

Característica

Klebsiella pneumoniae Klebsiella

oxytoca

Klebsiella terrigena^c

Klebsiella planticola^c

Klebsiella ornithinolytica^c subsp.

pneumoniae

subsp.

ozaenae

subsp.

rhinoscleromatis

Indol -^b - - + - V +

Ornitina descarboxilasa - - - - - - +

Lisina descarboxilasa + V - + + + +

Degradación de pectato - - - + - - -

Gas de lactosa a 44,5ºC + - - - - - -

Crecimiento a 10ºC - - - + + + +

Ácido a partir de:

D-melecitosa - - - V + - -

L-sorbosa V V V + + + -

Utilización de:

m-Hidroxibenzoato - - - + + - -

Hidroxi-L-prolina V V V V V + -

Malonato + - + + + + +

Test de rojo de metileno - + + - + V +

Reacción Voges-Proskauer + - - + + + +

a Datos recopilados de las referencias [11-18]

b - reacción negativa, +, reacción positiva; V reacción variable.

cActualmente pertenecientes al género Raoultella.

1.1.1 Importancia clínica de K. pneumoniae.

Las infecciones causadas por K. pneumoniae van desde infecciones leves del tracto urinario a bacteriemia, infecciones intra-abdominales y neumonías graves con una alta tasa de mortalidad y morbilidad [19-21]. En la mayoría de los casos se caracterizan por un curso clínico rápido complicado por abscesos pulmonares y de implicación multilobular, que deja escaso

margen de tiempo para poder establecer un tratamiento antibiótico eficaz. Además, K.

pneumoniae es uno de los microorganismos más comunes responsables de empiema [22].

Como se observa en la tabla 1.2, Klebsiella se encuentra entre los cinco primeros patógenos nosocomiales que afectan al tracto urinario. Es responsable de entre un 6% y un 17% de dichas infecciones y muestra incluso una incidencia mayor en grupos especiales de riesgo, como pacientes con diabetes mellitus [23]. Como causa de bacteriemias nosocomiales producidas por Gram negativos, Klebsiella es el segundo o tercer patógeno, únicamente por detrás de Escherichia coli y, en ocasiones, miembros del género Enterobacter [24-27]. En el caso de las neumonías Klebsiella está entre los cuatro patógenos nosocomiales más importantes, representando entre un 7% y 14% de dichas infecciones.

Por otra parte, las tasas de porte de Klebsiella en el intestino grueso varían entre un 5% y un 38% y entre un 1% y un 6% en la nasofaringe, y se pueden incrementar con la hospitalización, con la presencia de enfermedades severas subyacentes, como diabetes mellitus, y con el consumo de antibióticos en adultos y niños [2, 28].

Las infecciones nosocomiales debidas a Klebsiella son especialmente problemáticas en las unidades pediátricas, sobre todo en las unidades de cuidados intensivos y de neonatos. Las especies del género Klebsiella son patógenos relacionados con la sepsis neonatal (Tabla 1.2), tanto en infecciones neonatales tempranas como tardías [29, 30].

La aparición de aislados nosocomiales de K. pneumoniae multiresistentes a los antibióticos ha acentuado el interés por el estudio de los factores de virulencia de Klebsiella, así como el de los mecanismos que permiten a las bacterias adquirir resistencia a los antibióticos [31, 32].

Tabla 1.2. Infecciones nosocomiales más frecuentes provocadas por Klebsiella sp. [2]

Infección % Infecciones causadas por Klebsiella Posición Referencias

Infecciones del tracto urinario 6-17 5-7 [33-35]

Neumonía 7-14 2-4 [33, 34]

Infecciones de heridas 2-4 6-11 [34, 35]

Infecciones nosocomiales en UCI 4-17 4-9 [33-35]

Septicemia 4-15 3-8 [20, 25-27, 35, 36]

Septicemia neonatal 3-20 2-8 [30, 37-40]

1.1.2 Factores de virulencia de K. pneumoniae

Los factores de virulencia participan principalmente en la superación de los mecanismos de defensa innatos del huésped, aunque también pueden estar implicados en diferentes etapas del proceso de infección. Su importancia hace que se sigan realizando esfuerzos para la identificación de nuevos factores de virulencia, por ejemplo, a través del estudio de genotecas realizadas por mutagénesis dirigida [41].

En la actualidad, y en base a los estudios realizados sobre la virulencia de K. pneumoniae, los principales factores que contribuyen a su patogenicidad son: la cápsula, el lipopolisacárido, las fimbrias y adhesinas, y los sideróforos.

Cápsula.

La cápsula (CPS), que también recibe el nombre de antígeno K, es la estructura más externa de las envolturas celulares y, al estar en contacto directo con el medio, es el componente que protege a la bacteria de las condiciones ambientales adversas.

K. pneumoniae normalmente desarrolla cápsulas prominentes compuestas de polisacáridos acídicos complejos. Las unidades de repetición capsulares constan de cuatro a seis azúcares y, a menudo, ácidos urónicos como componentes cargados negativamente. Actualmente se conocen 77 serotipos diferentes [42]. La cápsula es esencial para la virulencia de K.

pneumoniae [43-49]. El material capsular forma estructuras fibrilares que cubren la superficie de la bacteria formando capas [50], protegiendo

a la bacteria de la fagocitosis por granulocitos polimorfonucleares y macrófagos alveolares [43, 45, 51-55]. Además de su función antifagocítica, se ha descrito que la CPS de K. pneumoniae inhibe la diferenciación y capacidad funcional de los macrófagos in vitro [56, 57]. La CPS también evita la opsonización y lisis de la bacteria por la acción del complemento evitando la unión de C3b a la bacteria [43, 54, 58]. [59]

Los estudios epidemiológicos demuestran que los serotipos capsulares más frecuentemente

aislados a partir de pacientes con infecciones del tracto urinario, neumonía o bacteriemia son K1 y K2 [60-62]. No se sabe a ciencia cierta a que se debe este hecho, pero una de las posibles

Figura 1.2. Fotografía de K. pneumoniae tomada con el microscopio electrónico de transmisión donde se puede apreciar la presencia de cápsula [59].

explicaciones es que el grado de virulencia conferido por un antígeno K determinado parece estar relacionado con el contenido de manosas de la CPS, concretamente por las secuencias manosa-α-2/3-manosa, ya que son las que determinan la eliminación de K. pneumoniae por parte de las defensas del huésped [53, 63]. Así pues, los tipos capsulares de baja virulencia como los antígenos K7 o K21a [52, 53, 64], contienen secuencias repetitivas de manosa-α-2/3- manosa o L-ramnosa-α-2/3-L-ramnosa, reconocidas por una lectina superficial de los macrófagos, que media la lectinofagocitosis, es decir, la fagocitosis independiente de opsonización [65]. Los macrófagos con la lectina específica para la manosa-α-2/3-manosa o receptor de manosa, reconocen, internalizan y matan a los serotipos de K. pneumoniae que contienen CPS con secuencias repetitivas de manosa-α-2/3-manosa o L-ramnosa-α-2/3-L- ramosa. Por el contrario, las cepas que carecen de estas secuencias repetidas no son reconocidas por los macrófagos y, por tanto, no son fagocitadas, que es lo que sucede en los tipos capsulares K1 y K2, ya que carecen completamente de estructuras manosa-α-2/3-manosa [64, 66].

Lipopolisacárido

El lipopolisacárido (LPS) es una molécula glucolipídica anclada a la cara externa de la membrana externa de la mayoría de bacterias Gram negativas que actúa como componente estructural y está claramente implicado en la resistencia de muchos microorganismos a los mecanismos de defensa del huésped. La cantidad de lipopolisacárido (LPS) producido varía entre cepas y está influenciado por las condiciones del medio donde crece la bacteria [67].

El LPS está compuesto por el lípido A, un núcleo oligosacárido y una cadena polisacarídica que recibe el nombre de antígeno O (figura 1.3).

- Lípido A o endotoxina, es una región compuesta por un disacárido de glucosamina unido a varios ácidos grasos. Su principal actividad biológica es el mantenimiento de la integridad de la membrana bacteriana. Su interés clínico reside en su función como endotoxina, ya que provoca la activación de los macrófagos, induce la respuesta inmunológica y tiene un efecto pirógeno.

- Núcleo, es una región oligosacárida central que contribuye de manera indirecta a servir de unión del antígeno O, auténtico factor de virulencia. Se ha comprobado que las tres regiones del LPS pueden actuar como inmunógenos, pero el núcleo presenta motivos estructurales muy conservados y, por tanto, se considera una diana adecuada para la inducción de anticuerpos de gran reactividad cruzada. En este sentido, se han obtenido anticuerpos a través de la inmunización de ratones con K. pneumoniae que reconocen de

manera altamente específica el núcleo de la especie, con independencia del serotipo de su antígeno O. Estos anticuerpos dirigidos contra el núcleo del LPS podrían utilizarse de tratamiento en pacientes con sepsis causada por bacterias Gram negativas.

- Antígeno O, es una región polisacárida conocida como D-galactano I que está constituida por la repetición de la unidad básica disacárida [→3-β-d-Galf-(1→3)-α-d-Galp-(1→]. El D- galactano I puede modificarse por O-acetilación o por la adición de otros dominios polisacáridos con una estructura básica diferente [68]. Estas diferencias en la composición de azúcares no solo se encuentran entre las diferentes especies de una bacteria Gram negativa, sino que también se encuentran entre las cepas de una misma especie bacteriana. La variabilidad de esta estructura y sus propiedades inmunogénicas han originado la descripción de hasta 9 serotipos diferentes de K. pneumoniae [69]. El serotipo O1 es el antígeno O que más comúnmente se ha encontrado en los aislados clínicos de K.

pneumoniae (figura 1.3). De sa fig [70]

El reducido número de serotipos O en K. pneumoniae es una gran ventaja para su aplicación como vacuna. Una vacuna multivalente compuesta por 8 tipos de LPS, o bien la inclusión del antígeno O1 en una vacuna de polisacárido capsular sería una aproximación prometedora [2, 71].

Figura 1.3. A. Representación esquemática de la estructura del LPS en K. pneumoniae. B. Estructuras de las diferentes cadenas de antígeno O aisladas de diferentes LPS desaminados procedentes de distintos serotipos de K. pneumoniae [70].

Lípido A Núcleo Antígeno O n

A B

-3) –β-Galp-α- Galp-(1- –β-Galf –(1- -3) –α-Galp-β- Galf-(1- -3) –α–Galp-PC

β-Galf- (1- -3) - α- Galp - (1-3)- β  – Galf -(1- -3) α- Galp- PC

-5)–β-Galf-(1-2)-β-GlucNAc–(1- –β-Galf – (1- -3)–α-Galp-β- Galf-(1- -3)–α–Galp- PC

-2) –α – Man (1-2) - α- Man (1-3)-α-Man – (1- –3) – α – Man – (1-3) – α- Man - PC

α  – KDO- (2-2)-β-Ribf- (1- -4) - α- Gal - (1-2)- β  – Ribf -(1- -4) α- Gal – (1- PC

Me –3)–α–Man–(1- -3)-β-Man-(1-2)-α–Man-(1- -3)-α-Man–(1-3)–α–Man– (1- PC

β  – KDO- (2-3)-α-Rha- (1- -3) - β- GlcNAc - (1-4)- α  – Rha -(1- – (1- PC

3) - β – GlcNAc – (1-5) – α – KDO – (2-6) - anhMan

α-Hep - (1-4)

Serotipo

O1

O1, O2a, O2a,c O2a,c

O3

O4

O5

O12

n n

n

n n

n

n

n

n

PC: Parte común

En K. pneumoniae se ha podido demostrar la importancia del antígeno O para la acción lítica del complemento. El mecanismo de resistencia al suero de dicho antígeno se basa en:

- la presencia o ausencia de dicho antígeno. Se ha visto que los mutantes de laboratorio desprovistos de este antígeno son sensibles a la acción lítica del complemento, activando tanto la vía clásica como la vía alternativa [72-74]. En cambio, las cepas en las que las cadenas laterales del antígeno O no están cubiertas ni protegidas por la cápsula, el componente C3b del complemento al unirse principalmente a las cadenas laterales O más largas, queda alejado de la membrana bacteriana, evitando la formación del complejo de ataque a la membrana y la lisis osmótica [75-78]. Así pues, las cadenas de antígeno O representan una barrera física que impide la correcta actuación de la cascada de reacciones de las proteínas del complemento y las cepas en las que el LPS presenta antígeno O únicamente activan la vía alternativa.

- la cantidad de C3b depositada [72]. La activación de ambas vías por parte de las cepas sensibles supone la deposición de elevados niveles de C3b y, por tanto, un mayor daño y muerte celular, mientras que en las cepas resistentes los niveles de C3b depositado son ineficaces para continuar la cascada del complemento [72].

Por lo tanto, la virulencia de las cepas de K. pneumoniae está fuertemente correlacionada con la CPS y el antígeno O [79].

También se ha visto que, en relación al papel del antígeno O respecto a la patogenia de la neumonía, dicho antígeno se presenta al huésped con una carga neutral [80]. Este enmascaramiento de las cargas implica una disminución de la unión de las partículas cargadas facilitando el establecimiento de la neumonía, por ejemplo, la unión entre los péptidos antimicrobianos y la superficie de la bacteria queda alterada, así como la unión con las defensinas del huésped [80]. Además, aunque se ha visto que la presencia del antígeno O no afecta a la diseminación de la neumonía, si que afecta a la capacidad de infección de Klebsiella, ya que cuando una cepa expresa antígeno O es más fácil de eliminar por los mecanismos del sistema inmune presentes en el pulmón [45].

En resumen, el antígeno O facilita el proceso inicial de adhesión y confiere resistencia a la bacteria contra la actividad bactericida del suero [2, 77].

Fimbrias y adhesinas.

Las fimbrias son proyecciones filamentosas no flagelares de la superficie bacteriana (figura 1.4). Estas estructuras tienen un diámetro entre 1 y 11 nm y pueden  medir   hasta   10  μm   de   longitud. Las fimbrias están formadas por subunidades proteicas globulares poliméricas con un peso molecular que oscila entre 15 y 26 kDa [81, 82]. Las propiedades de adhesión de las enterobacterias dependen generalmente de los distintos tipos de fimbrias o pili. Así pues, las fimbrias permiten al microorganismo mimetizar lo máximo posible las superficies mucosas del huésped y mantenerse próximo mediante la adhesión a sus células, paso fundamental para poder desarrollar un proceso infeccioso. Las fimbrias también determinan las propiedades de hemaglutinación.

De los distintos tipos de fimbrias descritas en las enterobacterias, en K. pneumoniae predominan los tipos 1 y 3. Ref fig [59]

Las fimbrias tipo 1 son las adhesinas mejor estudiadas. Estas fimbrias se unen a receptores glucoproteicos que contienen manósidos presentes en las células del organismo huésped, por lo que la manosa inhibe esta unión. Se ha observado en diferentes estudios que la adhesión mediada por fimbrias de tipo 1 es un importante factor de virulencia en las infecciones del tracto urinario causadas por K. pneumoniae, al permitir la colonización de la vejiga urinaria [83]. Además, la capacidad de unión de las fimbrias de tipo 1 a glucoproteínas solubles presentes en la saliva puede jugar un papel importante en la colonización del tracto respiratorio superior [84].

Si bien este tipo de fimbrias favorecen el establecimiento inicial del microorganismo en las superficies mucosas, su expresión en las etapas posteriores del proceso infeccioso resulta perjudicial ya que es una estructura reconocida por los sistemas de defensa del organismo huésped. Este tipo de fimbrias son reconocidas por receptores que contienen manosa presentes en la superficie de los leucocitos y activan la lectinofagocitosis. Para evitar este mecanismo de defensa la bacteria controla la expresión de fimbrias de tipo 1 pudiendo revertir al fenotipo no fimbriado [85]. En este sentido, el paso de un estado a otro está regulado por

Figura 1.4. Fotografía de K. pneumoniae tomada con el microscopio electrónico de transmisión donde se puede apreciar la presencia de fimbrias [59].

los genes fim, concretamente por la inversión de un segmento de ADN que contiene el promotor para el gen fimA. La orientación de dicho segmento de ADN invertible está controlado por el producto de los genes fimB y fimE que, respectivamente, median el estado de activación/inactivación o de solo inactivación de la expresión de los genes fim, dando como resultado una bacteria con o sin fimbrias [59, 86].

Las fimbrias de tipo 3 se expresan en la mayoría de cepas de K. pneumoniae y facilitan su adherencia a las células endoteliales, al epitelio del tracto respiratorio y a células uroepiteliales [87-89]. A diferencia de las fimbrias de tipo 1, las fimbrias tipo 3 están relacionadas con la formación de biofilms [90-92]. Estas fimbrias están codificadas por un grupo de 6 genes, los genes mrk. El gen mrkA codifica para la subunidad de la fimbria que polimeriza para formar el eje fimbrial, mientras que el gen mrkD codifica para la adhesina fimbrial y es importante para la formación de biofilms. Por otra parte, los genes mrkB, mrkC y mrkE parecen estar implicados en el ensamblaje del filamento fimbrial y en la regulación de su expresión. Por último, el producto del gen mrkF es necesario para el mantenimiento de la estabilidad de la fimbria en la superficie celular [90, 91, 93, 94].

Además de las fimbrias, en K. pneumoniae se han descrito otros tipos de adhesinas:

- la adhesina CF29K, codificada por el plásmido-R de K. pneumoniae, que promueve la adherencia a las líneas celulares humanas Intestine-407 y CaCo-2. Este tipo de adhesina parece idéntica a la CS31-A de las cepas de E. coli que provoca diarreas y proviene de la familia de las adhesinas K88. Los datos sugieren que CF29K es producto de la transferencia de los genes CS31-A desde E. coli a K. pneumoniae en el intestino humano[95].

- la adhesina KPF-28, similar a las fimbrias, se encuentra en la mayoría de las cepas de K.

pneumoniae resistentes  a  β-lactámicos y, presuntamente, es un factor de colonización del intestino humano [96].

- la CPS es otra macromolécula presente en la superficie bacteriana que puede participar en el proceso de adhesión. A pesar de que diferentes estudios indican que la CPS reduce la capacidad de adhesión de K. pneumoniae a células epiteliales procedentes de diferentes tejidos [67, 97], la adhesión de bacterias capsuladas únicamente se ve favorecida cuando interacciona con células epiteliales que presentan compuestos mucoides en su superficie celular. Estudios recientes sugieren que la CPS induce una respuesta inmunológica del huésped defectuosa al dificultar la unión de las bacterias y su internalización [98].

- el LPS también se ha considerado un factor de adhesión en K. pneumoniae.

Concretamente, se ha demostrado que el antígeno del LPS se une, in vitro, al receptor de manosa de los macrófagos, mediando la adhesión de este tipo de células [99].

Además, mutantes en el antígeno O del LPS presentan una reducción de adhesión a células epiteliales [100].

Sideróforos

Los sideróforos son proteínas quelantes con gran afinidad por el hierro y de bajo peso molecular, secretadas por las bacterias para asegurarse el aporte de hierro, elemento esencial para el crecimiento bacteriano, y capaces de competir con las proteínas del huésped [101].

En las enterobacterias los tres sistemas de sideróforos más frecuentes son la enterobactina, la aerobactina y la yersiniabactina. La enterobactina, también conocida como enteroquelina, fue el primer sideróforo bacteriano descrito, es un sideróforo tipo catecolato y lo producen más del 90% de los aislamientos enterobacterianos [102-104]. La aerobactina es un sideróforo tipo hidroxamato, lo producen una pequeña fracción de enterobacterias y tiene menor afinidad al hierro libre que la enterobactina o la yersiniabactina [105, 106]. El tercer tipo de sideróforo es la yersinoabactina, descrito por primera vez en especies de Yersinia pero encontrado en otras especies de enterobacterias, se cree que se transfiere por transferencia horizontal [107].

Hasta la fecha, se han realizado gran número de estudios para evaluar la regulación genética, la función y la capacidad de captación del hierro de cada uno de estos sideróforos [106, 108- 110]. También se ha investigado como afecta la deficiencia de uno o más de estos sideróforos en cepas de E. coli, tanto en su crecimiento en medios pobres en hierro como en su capacidad infectiva. Se ha visto que en modelos de infección del tracto urinario en ratón, cepas deficientes en aerobactina y enterobactina muestran una menor capacidad de diseminación en el riñón, sin embargo, mutantes deficientes sólo en aerobactina o enterobactina no presentan alteraciones ni en la capacidad de colonización ni en la diseminación [111].

En el caso de K. pneumoniae existe un importante número de estudios que han analizado la distribución de los sideróforos en aislados clínicos y que han determinado que casi la totalidad de dichos aislados producen enterobactina [112, 113], mientras que sólo un pequeño porcentaje de los mismos producen aerobactina o yersiniabactina [112, 114-116]. Sin embargo, no existen estudios concluyentes que hayan determinado el papel de cada uno de estos sideróforos en la virulencia de K. pneumoniae.

1.1.3 Mecanismos de resistencia a los antimicrobianos en K. pneumoniae.

El interés por el estudio de K. pneumoniae ha aumentado ya que, además de ser uno de los microorganismos más frecuentemente asociados a las infecciones nosocomiales, el número de aislamientos resistentes a los antibióticos ha incrementado notablemente [117-120].

De hecho, el uso de antibióticos junto con la prolongación de la estancia hospitalaria incrementan notablemente la probabilidad de infección por K. pneumoniae [118]. Además, la alta morbilidad y la mortalidad de las infecciones sistémicas graves producidas por Klebsiella a pesar del uso de una terapia antibiótica adecuada, hacen que se sigan estudiando los mecanismos de resistencia que presenta K. pneumoniae y también se considere a este patógeno como una importante fuente de transmisión de resistencia antibiótica.

En general, los mecanismos de resistencia a los antimicrobianos que más habitualmente presenta K. pneumoniae son tres (ver figura 1.5):

i) β-lactamasas que rompen los puentes amida  del  anillo  β-lactámico.

ii) Alteración de la permeabilidad de la membrana externa afectando a la penetración de los antibióticos.

iii) Bombas de expulsión o bombas de flujo que expulsan los antibióticos.

1.1.1.1 Enzimas  inactivadores  de  antibióticos:  las  β-lactamasas.

El   principal   mecanismo   de   resistencia   a   los   antibióticos   β-lactámicos es la expresión de β- lactamasas que inactivan estos antibióticos mediante la hidrólisis del   anillo   β-lactámico. La resistencia se puede deber a la activación natural o a mutaciones en los genes cromosómicos, o la adquisición de elementos genéticos extracromosómicos (plásmidos o transposones) portadores de genes que codifican estos enzimas [121].

Figura 1.5. Figura esquemática de los mecanismos de resistencia presentes en K. pneumoniae.

K. pneumoniae es intrínsecamente resistente a penicilina, ampicilina, amoxicilina, oxacilina, carbenicilina y ticarcilina debido a que expresa  una  β-lactamasa de forma constitutiva SHV-1, cuyo gen se localiza en el cromosoma bacteriano [122]. Para convertirse en resistente a las cefalosporinas  y  a  otros  β-lactámicos, K. pneumoniae necesita adquirir enzimas que hidrolizan las cefalosporinas como son las β-lactamasas. Hay dos tipos de β-lactamasas: las β-lactamasas de espectro reducido y las β-lactamasas de amplio espectro (BLEAs). Ambas se pueden localizar en plásmidos transferibles que también codifican la resistencia a otros agentes antimicrobianos, incluyendo cotrimoxazol (trimetoprima con sulfametoxazol), tetraciclinas, aminoglicósidos y más recientemente fluoroquinolonas [123, 124]. Así pues, estas β- lactamasas normalmente están codificadas por plásmidos de gran tamaño que contienen, al mismo tiempo, otros genes de resistencia antibiótica. Su localización plasmídica facilita la diseminación entre cepas y la acumulación de genes de resistencia. Por otra parte, hay que tener en cuenta que la expansión del espectro de substrato de una β-lactamasas se consigue mediante uno   o   dos   puntos   de   mutación   en   el   gen   codificante   de   dicha   β-lactamasa, en algunos casos estas mutaciones provocan que una β-lactamasa de reducido espectro se convierta en una BLEAs [125].

El número y tipo de β-lactamasas descubiertas ha ido creciendo a lo largo de los años.

Actualmente existen dos sistemas de clasificación de dichos enzimas, la clasificación molecular o clasificación de Amber y el sistema de clasificación de Bush y colaboradores (tabla 1.3). [126]

En el caso de K. pneumoniae las β-lactamasas más habituales pertenecen a los siguientes grupos:

1.- β-lactamasas tipo TEM y SHV.

2.- β-lactamasas tipo AmpC.

3.- β-lactamasas tipo CTX-M.

4.- β-lactamasas de clase A: Carbapenemasas.

5.- β-lactamasas de clase D: oxacilinasas (OXA).

6.- β-lactamasas de clase B: Metalo- β-lactamasas (MBL).

Los tres primeros grupos están más implicados en la resistencia a cefalosporinas, mientras que los tres últimos tienen gran importancia en la resistencia a los carbapenemas.

Grupo Bush- Jacoby (2009) Sistema de Bush- Jacoby-Medeiros (1995)

Clases moleculares. Sistema de Amber Sustratos Inhibidas por Características principales y enzimas representativos CA o TZBa EDTA 11CCefalosporinasNoNoMayor hidrólisis a cefalosporinas que a bencilpenicilina. Hidroliza cefamicinas. AmpC de E. coli, P99, ACT-1, CMY-2, FOX-1, MIR-1 1eNIb CCefalosporinasNoNoHidrólisis aumentada a ceftazidima y a otras oxiimino-β-lactámicos. GC-1, CMY-37 2a2aAPenicilinasSiNoMayor hidrólisis a bencilpenicilinas que a cefalosporinas. PC1 2b2bAPenicilinas y primeras cefalosporinasSiNoHidrólisis similar a bencilpenicilinas que a cefalosporinas. TEM-1, TEM-2, SHV-1 2be2beACefalosporinas de espectro extendido y monobactamSiNoHidrólisis aumentada a oxiimino-β-lactámicos (cefotaxima, ceftazidima, ceftriaxon, cefepime, aztreonam). TEM-3, SHV.2, CTX-M-15, PER-1, VEB-1. 2br 2br APenicilinasNoNoResistencia a ácido clavulánico, tazobactam y sulbactam. TEM-30, SHV-10 2ber NIACefalosporinas de espectro extendido y monobactamNoNoHidrólisis aumentada oxiimino-β-lactámicos combinada con resistencia a ácido clavulánico, tazobactam y sulbactam. TEM-50 2c2cACarbenicilina SiNoHidrólisis aumentada a carbenicilina. PSE-1, CARB-3 2ceNIACarbenicilina, cefepimeSiNoHidrólisis aumentada a carbenicilina, cefepime y cefpirome. RTG-4 2d2dDCloxacilina variableNoHidrólisis aumentada a cloraxilina o oxacilina OXA-1, OXA-10 2deNIDCefalosporinas de espectro extendidovariableNoHidrolizan la cloraxicilina o oxacilina y los oxiimino-β-lactámicos. OXA-11, OXA-15 2df NIDCarbapenemasvariableNoHidrolizan la cloraxicilina o oxacilina y los carbapenemas. OXA-23, OXA-48 2e2eACefalosporinas de espectro extendidoSiNoHidrolizan cefalosporinas, se inhiben por ácido clavulánico pero no por aztreonam. CepA 2f2fACarbapenemasvariableNoHidrolizan carbapenemas, oxiimino-β-lactámicos y cefamicinas. KPC-2, IMI-1, SME-1 3a3B (B1)CarbapenemasNoSiHidrólisis deamplioespectroincluyendocarbapenemasperono monobactam. IMP-1, VIM-1, CcrA, IND-1 B (B2)L1, CAU-1, GOB-1, FEZ-1 3b3B (B3)CarbapenemasNoSiHidrólisis de carbapenemas. CphA, Sfh-1 NI4No se conoce a CA: ácido clavilánico; TZB: tazobactam. b NI: No incluidas.

Tabla 1.4. Clasificación de lasβ-lactamasa [126]. a CA: ácido clavulánico; TZB: tazobactam. b NI: No incluidas.

β-lactamasas tipo TEM y SHV.

La primera vez que se describió una cepa de K. pneumoniae con  una  β-lactamasa SHV fue en 1985. Kliebe y colaboradores [127] describieron una cepa de K. pneumoniae procedente de Alemania   con   una   β-lactamasa tipo SHV-2, mutante de SHV-1, que deriva   de   la   β-lactamasa cromosómica de clase A de K. pneumoniae, y que era capaz de hidrolizar oxiimino- cefalosporinas. En el caso de las β-lactamasas tipo TEM aunque se cree que dicha familia tiene un ancestro común, su origen es aún incierto. El número de β-lactamasa de ambos tipos descubiertas ha ido aumentando a lo largo de los años y muchas veces debido a la aparición de mutaciones sobre la β-lactamasa inicial. En 1987 que Sirot y colaboradores [128] describieron varias cepas de diferentes especies de enterobacterias que presentaban una cefalosporinasa derivada de TEM-1 mediante la mutación de tres aminoácidos y que llamaron TEM-3 [129].

Hay que tener en cuenta que la mayor causa de la resistencia a las cefalosporinas de tercera generación en las Enterobacteriaceae son las β-lactamasas de clase A según la clasificación de Amber (tabla 1.4). Son de especial relevancia, las variantes de las TEM-1, TEM-2 y SHV-1 que se han generado por mutaciones de dichas β-lactamasas y les han permitido ampliar su especificidad de sustrato a las cefalosporinas de tercera y cuarta generación, en concreto, a cefotaxima,   ceftriaxol   y   ceftazidima.   Estas   β-lactamasas muestran un amplio rango de sustituciones aminoacídicas que conllevan a la ampliación de la especificidad del sustrato.

Estas mutaciones afectan al reconocimiento de los sustratos y al ratio de formación e hidrólisis del complejo acil-enzima.  Hay  suficientes  evidencias  de  que  las  β-lactamasas de clase A sufren varios cambios conformacionales inducidos por la unión y la reacción con el sustrato.

Paralelamente, otros sustratos experimentan reorganizaciones químicas llevadas a cabo por ataques enzimáticos que pueden dirigir cinéticas más complejas. La interacción de ambos procesos tiene como resultado un espectro del sustrato ampliado y diferentes ratios de hidrólisis para las diferentes cefalosporinas [130].

Actualmente, las variantes de TEM y SHV catalogadas ha crecido hasta 185 y más de 140 respectivamente, (ver http://www.lahey.org/Studies/) la mayoría de ellas con actividad contra las oxiimino-cefalosporinas. Las primeras variantes de TEM y SHV, identificadas los años 1970 y 1980 se caracterizan por la hidrólisis de cefalosporinas de primera y de segunda generación y se inhiben por ácido clavulánico y tazobactam; incluyen las enzimas TEM-1, TEM-2 y SHV-1 y forman  parte  las  serin  β-lactamasas. Posteriormente  se  han  encontrado  β-lactamasas del tipo TEM y SHV, como TEM-30, TEM-31, TEM-163, SHV-10 y SHV-72, que tienen el mismo espectro de  actividad  frente  a  los  β–lactámicos pero son resistentes al ácido clavulánico y al tazobactam [126].