Teststrategi og metodevalg ved OUS for diagnostikk av

(1)

Teststrategi og metodevalg ved OUS for diagnostikk av

autoimmune leversykdommer

Randi Karlsen Fagbioingeniør

Seksjon for medisinsk immunologi Oslo Universitetssykehus

Ullevål sykehus

April 2016

(2)

Innhold

• Test repertoar

• Test strategi

• Metoder

• Guidelines

(3)

(4)

(5)

Analysepakker

(6)

Test repertoar ved OUS

• ANA-IIF (kjerneantistoff og cytoplasmaantistoff)

• SMA (antistoff mot glattmuskel)

• AMA (antistoff mot mitokondrier)

• LKM (antistoff mot liver/kidney mikrosomalt)

• LC-1 (antistoff mot levercytosol)

• SLA/LP (antistoff mot soluble liver antigen/ liver pancreas protein)

• ANCA-IIF (P-ANCA)

• IgG, IgA og IgM

• ALD-Blot: a-M2, a-3E(BPO), a-LC1, a-LKM1, a-SLA/LP,

a-PML, a-Sp100, a-gp210,

(7)

TEST-STRATEGI

LEVER DIAGNOSTIKK

LKS ANA

IgG, A, M

Hep-2 PH50

CTD OG A-M2 KJERNE OG

CYTO-

PLASMATISK MØNSTER OG STYRKE

LKS-IIF

MØNSTER EV.

TITRERING

AKTIN- ELISA

ALD- BLOT

IMMUN-

GLOBULINER - NEFELOMETRI

2. LINJE ANALYSE: ALD-BLOT

(8)

Metoder

• Indirekte immunfluorescens

Vevssnitt av gnager lever, nyre og mage Hep-2

Transfekterte celler

• Elisa

FEIA

• Immunoblot

Line immunoassay, dot blot

(9)

Indirekte immunfluorescens LKS-slides

• Tre sammensatte organer fra mus

• Kan teste på flere antistoffer samtidig SMA, AMA, LKM, LC-1, GPC og ANA

• Screening fortynning 1/40

• Titrering av positive 1/80, 1/256 og 1/1280

• IgG spesifikt konjugat

• Må ha fluorescensmikroskop og kompetanse

• Kan automatiseres, billig og effektiv.

(10)

Negativ nyre, mage

(11)

Antistoff mot glatt muskel (SMA)

Kan påvises hos ca. 80 % av pasientene med AIH (autoimmun hepatitt) type 1. Deles i undertyper basert dels på reaksjonsmønster i vevssnitt, dels på antigenkarakterisering. Den viktigste

undertypen har et såkalt VGT-mønster, som viser at det foreligger antistoff mot F-aktin Mønsteret sees hos ca. 80% av pasienter med AIH. Mønsteret har en sensitivitet på ca. 80% og en spesifisitet på over 90 % for AIH-type1. Andre varianter av anti-glattmuskulatur er nokså

uspesifikke og trolig av beskjeden diagnostisk verdi.

Analysen har liten verdi av måling for

sykdomsaktivitet eller prognose.

(12)

Ulike mønstre:

V (vessel): Fluorescens i cytoplasma til muskelcellene i Muscularis Mucosa, muskelceller i kar og muskelfibre mellom parietalcellene.

VG (Vessel + glomeruli): Som over, men også markant farging i glomeruli (mesangialt).

VGT (Vessel + glomeruli + tubuli): Som over, men også nålelignende farging peritubulært i nyrebarken samt i ytterkant av parietalceller.

V-mønster er lite spesifikk for AIH

VGT-mønster er svært spesifikk for AIH og assosieres med anti-F- aktin

Titer 80 eller høyere er viktig for diagnose score Titer 40 kan bety noe.

(13)

SMA på mage, nyre

(14)

VGT mønster på nyre og mage

(15)

Antistoff mot mitokondrier (AMA)

Har vært delt i 10 eller flere undertyper basert vesentlig på

reaksjonsmønster i vevssnitt, i noen grad på antigenkarakterisering.

Diagnostisk betydning av de fleste av disse subspesifisitetene er usikker.

Den diagnostisk mest interessante varianten er (M2), som finnes hos 90–

95 % av pasientene med primær biliær cholangitt (PBC), og som kan

opptre mange år før klinisk sykdom utvikles Det er ukjent hvor mange av pasientene med mitokondrieantistoff, men uten leversykdom, som

senere vil utvikle PBC.

Mitokondrieantistoff kan også sees hos noen pasienter med autoimmun hepatitt (gjerne lave titer), hepatitt C og systemisk sklerose, samt mer sporadisk ved en del andre tilstander.

Analysen har ingen verdi mht. måling av sykdomsaktivitet eller vurdering av prognose hos pasienter med etablert PBC.

M2-reaktiviteten omfatter E2 -subenhetene i tre enzymkomplekser:

Pyruvate dehydrogenase complex E2 (PDC- E2)

2-oxo-glutarate dehydrogenase complex E2 (OGDC-E2)

Branched chain 2-oxo-acid dehydrogenase complex E2 (BCOADC-E2)

(16)

Mønster

• Kornet fluorescens i nær alle nyretubuli i margen(distale tubuli).

Kornet fluorescens i proksimale tubuli i barken P1>P2>P3.

• Kornet fluorescens i cytoplasma av parietalceller og hovedceller i magen. Oppklaring av den sekretoriske kanal og skarp

celleavgrensning er karakteristisk. Kornet farging i leverparenchymet.

• OBS. Mulighet for prozone fenomen hvor det ikke er typisk farging i nyren, men med prikker (relativt tett). Må titreres.

• Positiv test bekreftes med annen teknikk.

• Titer >40 regnes som spesifikk for PBC (primær biliær cholangitt)

• Ikke for monitorering. Flukterer ikke med sykdomsaktivitet.

(17)

AMA på nyre, mage og lever

(18)

AMA på Hep-2

(19)

LKM

• Forkortelsen LKM står for liver, kidney mikrosomal autoantibodies.

• Anti-LKM1, 2 og 3 er rettet mot tre forskjellige enzymer i det

endoplasmatiske retikulum i leverparenkym og nyretubuli. LKM1 og 3 er vanskelig å skille mikroskopisk i nyre og lever fra gnager.

• LKM1 reagerer med cytokrom P450 2D6. Er markør for en

undergruppe AIH (type2), som er karakterisert ved negativ ANA, forekommer hos yngre kvinner (ofte barn).

• Anti-LKM2 er rettet mot enzymet cytokrom P450 2C9. Medikament indusert.

• Anti-LKM3 er rettet mot enzymet UTG1A (UDP-

glucuronosyltransferase 1A). Sees ved HepC, HepD og AIH.

(20)

Mønster

• Partiell farging i nyren. Relativt homogen farging innerst i barken, mer variabelt utover i barken. Ingen farging i marg.

• Kraftig, relativt homogen farging av leverparenchym

• Vanskelig å se forskjell på LKM-1, 2 og 3

• Positiv test bekreftes med annen metode (LIA)

• LKM1 er assosiert med AIH type2

(21)

LKM-1 på nyre og lever

(22)

negativ på distale tubuli

(23)

LC-1

• Opptrer ofte sammen med anti-LKM1, og er da vanskelig å påvise.

Nyremarg: Ingen fluorescens.

Nyrebark: Ingen fluorescens.

Magesekk: Ingen fluorescens.

Lever: Fluorescens i leverparenchymet med sentral- lobulær avbleking

• Positiv test bekreftes i annen teknikk (LIA)

• Assosiert med AIH type 2

(24)

LC-1 på lever

(25)

ANA- indirekte

immunfluorescens

• Ved AIH kan det være flere målantigener Negativ på vanlige undergrupper

Kan være kromatin assosiert

• Substrat av gnager eller Hep-2

• Serumfortynning 1/40 er relevant

• Ved PBC

Centromer, nukleær membran, multiple nukleære dots

• Ved andre autoimmune tilstander og hos friske

(26)

Multiple nukleære dots og

punktert nukleær membran på

Hep-2

(27)

ANCA

• Atypisk p-ANCA

• P-ANNA: perifer antinukleær nøytrofil

antistoff (antigen i membranen)

• Ved PSC (primær skleroserende cholangitt) og AIH

• a-Pr3 positiv hos IBD?

(28)

Anti-SLA/LP

• Sees ikke ved IIF-metodikk

• Elisa eller LIA

• AIH type 3 ?

• Oftest ingen andre autoantistoff

(29)

Oppfølgingstester

• Mitokondrieantistoff FEIA: Phadia250

EliA brønn coatet med både nativt pyruvat dehydrogenase-kompleks fra mitokondrier og i tillegg det rekombinante M2-antigenet BCOADC-E2

LIA: Euroline blotmaster fra Euroimmun

Native M2 antigen

M2-3E (BPO): består av

E2-BCOADC, E2-PDH og E2-OGDC

(30)

Anti-glatt muskel positive

Anti-F-Aktin: Elisa-kit fra INOVA

Settes pt opp på alle SMA positive også de med mønster V.

Finnes hos 52-85% med AIH eller

kronisk aktiv hepatitt og hos 22% av

pasienter med PBC, men også hos 3-

18% friske.

(31)

Line-immunoassay

ALD-blot fra Euroimmun

• MA-M2= native M2 antigen

• M2-3E (BPO) :E2-(BCOADH), -(PDH) og -(OGDH)

• Sp100= speckled protein (100 kDa);

• PML= promyelocytic leukemia protein;

• gp210= glycoprotein (210 kDa);

• LKM-1= cytochrome P450 IID6;

• LC-1= formiminotransferase cyclodeaminase

• SLA/LP= UGA-suppressor-tRNA associated protein

(32)

• Mange antigener coated på en strips av plast. Membran av nitrocellulose eller nylon

• Detekterer mange antistoffer samtidig

• Fra manuell til helautomatisk prosess

• Fargeintensiteten leses av og graderes,

reflekterer antistoff aktiviteten

(33)

ALD-blot

Positiv kontroll

Ani-Sp100

(34)

Ting å tenke på

• Valg av metode

• Valg av teststrategi

• Kvalitetskontroller

• Ekstern kvalitetskontrollprogram

(35)