Effekt av TGF-β3 på humane cellers strålefølsomhet

Effekt av TGF-β3 på humane cellers strålefølsomhet

Effekten av TGF-β3 sammen med

peroksinitritt(ONOO

) på T-47D kreftcellers følsomhet for røntgenstråling

Pejman Mansouri Samani

Masteroppgave ved Fysisk institutt

Det matematisk-naturvitenskapelige fakultet UNIVERSITETET I OSLO

Desember 2016

II

III

Effekt av TGF-β3 på humane cellers strålefølsomhet

-

Effekten av TGF-β3 sammen med

peroksinitritt(ONOO

) på T-47D kreftcellers følsomhet for røntgenstråling

Masteroppgaven er gjennomført ved

Seksjon for Biofysikk og Medisinsk Fysikk (BMF) Fysisk institutt

Det matematisk-naturvitenskapelige fakultet Universitetet i Oslo

© Forfatter År 2016

Tittel «Effekt av TGF-β3 på humane cellers strålefølsomhet»

Forfatter Pejman Mansouri Samani http://www.duo.uio.no/

Trykk: Reprosentralen, Universitetet i Oslo

IV

Sammendrag

Forskning fram til nå, viser at prebehandling av celler med TGF-β3 kan fjerne hypersensitivitet (HRS). Det er også noen indikasjoner på at dette cytokinet kan øke

overlevelsesfraksjonen for celler bestrålt med testdoser opptil 5 Gy. Senere forskning har vist at tilstedeværelse av peroksinitritt er nødvendig for at TGF-β3 skal kunne utøve disse

funksjonene.

Denne oppgaven har som hovedmål å studere den strålevirkningsmodifiserende effekten av å forbehandle eller etterbehandle T-47D-celler med TGF-β3 de siste 24 timene før, eller de første 24 timene etter, at cellene bestråles med store testdoser på 5 eller 10 Gy. En høy doserate (HDR) røntgenstråling på 0,5 Gy/min brukes til bestråling av celler og medium.

I tillegg undersøkes det om tilsetting av nitrogenoksid (NO) eller peroksinitritt (ONOO^-) påvirker effekten av for- eller etterbehandlingen av T-47D-celler med TGF-β3 bestrålt med store testdoser (5-10 Gy).

Som overlevelseskriterium brukes sannsynligheten for at den bestrålte cellen kan danne en koloni. Resultatene analyseres ved å gjøre kurvetilpasning til de eksperimentelt målte overlevelsesfraksjonene som funksjon av dose med Linear-Quadratic-modellen (LQ- modellen).

Det ble i tillegg gjort forøk for å måle den strålemodifiserende effekten av forbehandling med TGF-β3, TGF-β3+NO eller TGF-β3 + ONOO^- på en annen cellelinje, en sub-linje av T-47D som kalles T-47D_s^C2. T-47D_s^C2-celler er av interesse siden tidligere forsøk har vist at de er avhengig av ekstern tilførsel av ONOO^- for at TGF-β3 kan fjerne HRS.

En generell oppsummering av funnene kan gjøres som følger: Det er ikke påvist noen strålemodifiserende effekt hverken av TGF-3 alene eller i kombinasjon med NO eller ONOO^- for store stråledoser (5-10 Gy). Dette gjelder uansett om stoffene ble tilsatt 24 timer før bestråling eller 24 timer etter bestråling. Det gjelder også begge de to undersøkte

celletypene. I ett av forsøkene tyder imidlertid resultatene på at TGF-3 tilsatt 24 timer etter bestråling ga økt celleoverlevelse, men kun for en mindre dose på 2Gy. Ikke heller i dette forsøket ble det påvist noen dosemodifiserende effekt av TGF-3 ved bestråling med 5 eller 10 Gy. I fremtidige forsøk vil det være av interesse å undersøke om det finnes et terskelnivå med hensyn til effektdose for den strålemodifiserende effekten av TGF-3.

V

Forord

Arbeidet presentert i denne oppgaven er utført ved seksjon for biofysikk og medisinsk fysikk, Fysisk institutt, Universitetet i Oslo.

Først av alt vil jeg takke mine veiledere Erik Olai Pettersen og Joe Alexander Sandvik for god veiledning, hjelp og tålmodighet gjennom arbeidet med masteroppgaven.

Jeg vil også takke Nina Jeppesen Edin for hennes hjelp og veiledning, både med tanke på laboratoriearbeidet og arbeidet med oppgaveteksten.

Jeg er dypt takknemlig til Grete Stavik-Døvle og administrasjonen i Fysisk institutt for deres hjelp og veiledning med reglement, frister og krav.

Jeg vil også takke:

Mine medstudenter, Elektra Kalaitzidou, Ioanni Veras, Anne Marit Rykkelid og Torgeir Mo, som har hjulpet meg med dette prosjektet.

Alle i gruppen for Biofysikk og medisinsk fysikk, spesielt Einar Sagstuen og Eli Olaug Haugen.

Gamle og nye LilleFy-beboere, for lån av sofa og gratis kaffe.

Arnfinn Aamodt for korrekturlesing, opplæring i statistikk, støtte og oppmuntring.

Til slutt vil jeg takke min familie for ustanselig støtte gjennom hele studietiden.

Oslo, desember 2016 Pejman Mansouri

VI

VII

Innholdsfortegnelse

1 Innledning ... 1

2 Teoretisk bakgrunn ... 3

2.1 Cellesyklus... 3

2.1.1 Kontroll av cellesyklusprogresjon ... 4

2.1.2 Sjekkpunkter og cellesyklusstopp ... 5

2.1.3 G₁/S sjekkpunktet ... 6

2.1.4 G2 sjekkpunktet ... 8

2.2 Effekten av ioniserende stråling på celler ... 9

2.2.1 Direkte- og indirekte effekter av ioniserende stråling ... 9

2.2.2 Dose og doserate ... 9

2.3 Reparasjonsmekanismer ... 10

2.3.1 Reparasjon av SSB ... 10

2.3.2 Reparasjon av DSB ... 11

2.4 Celleoverlevelse og LQ-modellen ... 11

2.5 Stråleresistens ... 12

2.5.1 Hypersensitivitet (HRS/Hyper Radio Sensitivity) ... 13

2.5.2 TGF-β3, The Growth Factor β3 ... 14

2.5.3 HRS, TGF- β3 og NO ... 14

3 Materialer og metoder ... 16

3.1 Generelt om koloni-teknikken ... 16

3.2 Cellelinje ... 16

3.3 Utstyr ... 17

3.3.1 Cellekultiveringsutstyr ... 17

3.3.2 Bestrålingsutstyr ... 19

3.3.3 Fikseringsutstyr ... 20

3.3.4 Plottings- og analyseutstyr ... 20

3.4 Sterilitet og kontaminasjon ... 20

3.5 Eksperimentgjennomføring (Protokoll) ... 22

3.5.1 Første sett med forsøk ... 22

3.5.2 Andre sett med forsøk ... 24

3.5.3 Tredje og fjerde sett med forsøk ... 25

VIII

3.6 Matematisk analyse av eksperimentelle data ... 25

3.6.1 Utregning av overlevelsesfraksjonen ... 25

3.6.2 Multiplisitet ... 27

3.6.3 M-korrigert overlevelsesfraksjon, f ... 27

3.6.4 Utregning av gjennomsnittet for ett sett med eksperimenter ... 29

3.7 Presentasjon av data ... 30

4 Resultater ... 31

4.1 Doserespons til T-47D-celler... 31

4.2 Effekten av tilsetting av TGF-β3 og NO på overlevelsesfraksjonen 24 timer etter testdosen ... 32

4.3 Kondisjonering av T-47D-celler med TGF-β3 og NO 24 timer før testdosen ... 37

4.4 Kondisjonering av T-47Dsc2 -celler med TGF-β3 og NO 24 timer før testdosen... 41

4.4.1 Resultater med 6 forsøk ... 41

4.4.2 Resultater med 5 forsøk ... 44

5 Analyse og diskusjon ... 48

5.1 Doseresponskurven til T-47D-celler ... 48

5.2 Effekten av etterbehandling av T-47D-celler med TGF-β3 og NO 24 timer etter testdosen ... 50

5.3 Effekten av kondisjonering av T-47D-celler med TGF-β3 og NO 24 timer før testdosen ... 55

5.4 Dosereponskurven for T-47Dsc2 -celler ... 57

5.5 Effekten av prebehandling av T-47D-celler med peroksinitritt eller nitrogenoksid på doseresponsen ved store doser ... 60

5.6 Utfordringer, ubesvarte spørsmål i denne oppgaven og videre forskning ... 61

5.6.1 Mulige eksperimenter og videre studier ... 61

6 Konklusjon ... 63

Vedlegg A) Detaljert oversikt over gjennomførte eksperimenter ... 64

Referanseliste ... 133

IX

Forkortelse og uttrykksliste:

ATM Ataxia-Telangiectasia mutated

ATR Ataxia Telangiectasia and Rad3 related Cdc25 Cell Division Cycle 25

Cdk Cyclin Dependent Kinase

Chk1/Chk2 Checkpoint Kinase 1/ Checkpoint Kinase 2 CKI Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor

DEANO DiEthylAmine Nitogen monOxide

DNA DeoxyriboNucleic Acid

DSB Double Strand Break

HDR High Dose Rate

HeLa Henrietta Lacks cellelinje iNOS inducible Nitic Oxide Synthase LAP Latency Associated Protein

LDR Low Dose Rate

LET Linear Energy Transfer

LQ-model Linear Quadratic model

Mdm2 Mouse Double Minute 2 homolog

Moderflaske En flaske med celler som blir sådd ut til nye flasker til eksperimenter

p53 Protein 53

p21 Protein 21

PBS Phosphate Buffered Saline

pRb Retinoblastoma protein

Rb Retinoblastoma protein

RNA RiboNucleic Acid

RPM Revolutions Per Minute

RPMI Roswell Park Memorial Institute medium

X

SSB Singel Strand Break

T-47D En type brystkreft celler

TGF-β3 Transforming Growth Factor beta, i medisin kan den også kalles «avotermin»

Rettelse:

På akser i enkelte grafer i denne oppgaven ble uttrykket «overlevelsesraten»

brukt i stedet for «overlevelsesfraksjon». Dette ble oppdaget for sent for å kunne

rettes opp før innlevering av oppgaven.

1

1 Innledning

Siden tidlig på 1990-tallet har det vært kjent at mange celletyper viser en ekstrem

strålefølsomhet ved meget små stråledoser levert som akutt bestråling¹, det vil si doser opp til ca. 0,3 Gy. (Lambin, Marples, Fertil, Malaise, & Joiner, 1993) Dette fenomenet kalles

hypersensitivitet (HRS, eller Hyper Radio Sensitivity). For noen celletyper er det vist at opp til ca. 30% av de bestrålte cellene kan bli inaktivert av akuttbestråling med en dose på 0,3 Gy.

Imidlertid ser man gjerne at noe større doser (på 0,5 – 1 Gy) faktisk gir den samme eller mindre inaktivering, altså at cellene er mer resistente for store doser. I litteraturen omtales dette fenomenet som indusert stråleresistens (IRR; eller Induced Radio Resistance).

Tidligere eksperimenter har vist at brystkreftceller, T-47D, mister hypersensitivitet ved å bli utsatt for en liten dose prebestråling. Denne effekten er kortvarig ved bruk av høy doserate under prebestrålingen, men blir langvarig eller permanent² ved bruk av lav doserate (Nina Jeppesen Edin, Sandvik, Olsen, & Pettersen, 2009). Denne effekten ble også observert dersom man først prebestrålte mediet til ubestrålte celler og ga disse cellene en effektutløsende

bestråling (Nina Jeppesen Edin et al., 2009).

Den økte stråleresistensen, som følge av prebestråling, ble observert med testdoser opp til 5 Gy. Man kan tenke seg at denne økte strålsresistensen kan påvirke doseeffekten av

strålebehandling etter for eksempel et CT-skann. Det er tenkbart at strålebehandlingen kan ha mindre effekt som følge av CTs prebestråling av kreftceller.

Senere eksperimenter indikerte at tilsetting av cytokinet Transforming Growth Factor β3 (TGF-β3) medvirker til å gi en økning av cellenes stråleresistens (N. J. Edin, Sandvik, Cheng, Bergersen, & Pettersen, 2014). Eksperimenter som hittil er gjennomført har fokusert på lave testdoser, opptil 5 Gy.

Selv om man har observert økt stråleresistens, er de molekylære mekanismer som bidrar til denne økte stråleresistensen, som følge av tilsetting av TGF-β3, ukjent.

In vitro eksperimenter som er gjennomført i vår forskningsgruppe har hatt spesielt fokus på T- 47D-celler selv om vi også har målt eliminasjon av HRS ved hjelp av TGF-β3 i andre

cellelinjer (N. J. Edin et al., 2014). T-47D-celler viser en mer markant HRS sammenlignet med andre cellelinjer med HRS og er derfor valgt til våre eksperimenter. I tillegg til villtypen T-47D-celler er det også gjennomført lignende eksperimenter med en datterlinje av T-47D- celler som er kalt T-47D_s^C2.

Denne sub-linjen representerer etterkommere av villtype T-47D-celler som overlevde

virkning av variabel hypoksi og langtidsbestråling ved lave doserater (Stine Gyland Mikalsen, 2016).

1 Høy doserate, typisk >0,5 Gy/min

2 Effekten har vart i over 5 år

2

T-47D_s^C2-celler viste HRS som villtypen T-47D-celler. Til forskjell fra villtypen ble imidlertid ikke HRS eliminert ved å utsette T-47DsC2

-celler til TGF-β3. Eliminasjon av HRS ble observert ved å tilsette medium som inneholdt TGF-β3 og peroksinitritt til T-47DsC2

-celler før testdosen ble gitt (Personlig kommunikasjon med Nina J. Edin).

In vivo forsøk med etterbehandling av mus, som ble utsatt for en testdose som tilsvarer LD₅₀³, med TGF-β3 ble også gjennomført i 2015. Etterbehandlingen viste seg å ha en reduserende effekt på dødeligheten som følge av den gitte testdosen (Personlig kommunikasjon med Nina J. Edin).

I denne oppgaven bygger vi videre på tidligere forsøk og publikasjoner. Vi ser på effekten av TGF-β3 på overlevelsen i T-47D-celler ved større doser enn det som tidligere er undersøkt, dvs opp til 10 Gy.

Vi undersøker om TGF-β3 alene kan påvirke strålefølsomheten til T-47D-celler. Vi tester også om NO påvirker effektiviteten av TGF-β3. Til slutt ser vi på om bestråling av mediet som inneholder TGF-β3 og NO-donor molekyler (uten celler), med 1 Gy, før mediet tilsettes T-47D-celler, forandrer effektiviteten av TGF-β3+NO.

Vi måler celleoverlevelsesfraksjonen med koloniteknikken⁴. Forsøkene gjøres med å tilsette det modifiserte mediet før testdosen gis.

Dette eksperimentet gjentas ved å tilsette det modifiserte mediet etter testdosen gis. Vi tester også effekten av TGF-β3 og NO på T-47DsC2

-celler.

Vi sjekker også om vi kan observere en økt celleoverlevelse med etterbehandling av T-47D, med modifiserte medier⁵, etter at testdosen er gitt, slik det er observert med in vivo

eksperimenter.

3 Lethal Dose 50 er en testdose som dreper 50% av populasjonen

4 På engelsk kalles denne metoden «Colony assay method»

5 Medium som inneholder TGF-β3, TGF-β3+NO eller TGF-β3+NO som gis akuttbestråling på 1 Gy

3

2 Teoretisk bakgrunn ⁶

Denne oppgaven undersøker effekten av TGF-β3 og peroksinitritt på cellenes strålefølsomhet.

Vi trenger ett grunnlag av teoretisk bakgrunn for å kunne forklare problemstillingen og konklusjoner som vi kommer fram.

2.1 Cellesyklus

Cellesyklus sier noe om forskjellige faser som en celle går gjennom til celledelingen. Generelt deles cellesyklus, for eukariotiske celler, i fire faser. G1-, S- og G2-fasene kalles til sammen for interfasen. I M-fasen, som er mitosen, skjer celledelingen.

I G₁-fasen, som står for Gap 1, vokser cellene i størrelse og nødvendige materialer til DNA- replikasjon samles i cellen. Etter G₁-fasen, starter DNA-replikasjonsprosessen i S-fasen, som står for syntese.

Mellom DNA-syntese og mitosen er det en ny fase, G2. I denne fasen vokser cellen i størrelse.

Med mitosen starter celledelingen. Mitosen blir delt i 5 faser igjen: profase, metafase, anafase, telofase og cytokinese⁷. De forskjellige steg i cellesyklus er illustrert skjematisk i figur 1-1.

Som figur 1-1 viser, i G₀ gjennomgår ikke celle cellesyklus.

M-fasen er kort sammenlignet med interfasen. For eksempel i HeLa-celler varer mitosen i 1 time mens interfasen varer 23 timer.⁸

6 Teorikapittelet ble skrevet primært basert på lærebøker (Alberts et al., 2015) og (Hall & Giaccia, 2012) og undervisningsmaterialer fra FYS4720 - Cellulær radiobiologi

7 Cytokinese kan også regnes som egen celledelingsfase separert fra mitosen.

8 Hentet fra tabell 4.1 i (Hall & Giaccia, 2012)

4

Figur 1-1 En illustrasjon av cellesyklusens faser og hvilke funksjoner som gjennomgås i hver fase⁹.

2.1.1 Kontroll av cellesyklusprogresjon

Progresjonen gjennom cellesyklus er styrt av et nettverk av proteiner. De viktigste av disse proteinene er forskjellige komplekser av sykliner og syklinavhengige kinaser (CDK), som avløser hverandre gjennom cellesyklus. Aktiviteten av disse kompleksene, som selv er kinaser, varierer gjennom cellesyklus og kontrollerer og aktiverer proteiner med forskjellige oppgaver. CDK-proteinenes kinasefunskjon aktiveres ved binding til et syklin. Sykliner er proteiner som produseres og nedbrytes i løpet av cellesyklus. Dermed blir tilgjengeligheten av sykliner regulert. Sykliners tilgjengelighet regulerer fremdriften i cellesyklus. Denne

variasjonen av tilgjengelighet har gitt opphav til navnet syklin. (se figur 1-2)

Det finnes hovedsakelig to måter å kontrollere CDK-s aktivitet på: tilgjengelighet av sykliner og fosforyleringen av CDK. En CDK kan også bli deaktivert av en CKI (Cycline Kinase Inhibitors). En CKI er som en nødbrems som stopper CDKs aktivitet selv om CDK-en er aktivert.

Oppsummert kan aktiviteten av CDK-syklin-kompleksene og dermed progresjonen gjennom cellesyklus kontrolleres på tre forskjellige måter (Forsburg, 2000):

1. Fosforylering/defosforylering av CDK syklin komplekser 2. Regulering av CDK-aktivitet ved hjelp av inhibitorer, CKI 3. Destruering av sykliner og inhibitorer

9 Bildet er hentet fra: http://www2.le.ac.uk/departments/genetics/vgec/diagrams/22-Cell-cycle.gif

5 Disse reguleringsmekanismer gjør at cellesyklus foregår fremover og med riktig tempo.

Figur 1-2 Grafisk illustrasjon som viser tilgjengelighet av forskjellige sykliner i løpet av cellesyklusen.(figuren er hentet fra (Alberts et al., 2015))

Initiering av celledelingen og celleveksten blir styrt av tre eksterne faktorer (Alberts et al., 2015):

 Mitogener som er eksterne signaler som stimulerer celledelingsprosessen gjennom stimuleringen av G1/S-CDK og deres aktivitet.

 Vekstfaktorer som promoterer proteinsyntese og dermed økt cellestørrelse

 Overlevelsesfaktorer som undertrykker apoptose¹⁰

Disse eksterne faktorer påvirker cellens reguleringsmekanismer gjennom stimulering eller undertrykking. Med andre ord kan eksterne faktorer initiere cellesyklus men progresjonen reguleres av interne mekanismer.

2.1.2 Sjekkpunkter og cellesyklusstopp

Det er viktig at celledelingsprosessen produserer to kopier av modercellen som er identiske med modercellen. Derfor er det nødvendig at cellens DNA-struktur blir bevart.

I hvert steg av cellesyklus finnes en viss sannsynlighet for at DNA blir skadet. DNA-skader kan medføre at cellen dør eller mister sin funksjonalitet. I løpet av cellesyklus finnes flere sjekkpunkter som sjekker DNA og DNA-synteseprodukter for feil/skader. Dersom slike feil blir oppdaget, stoppes cellesyklus.

Etter cellesyklusarrest kan flere prosedyrer begynne. Cellen kan initiere reparasjoner, stoppe celledelingen og gå i G0-dvale eller starte apoptose

10 Apoptose er planlagt celledød der cellen oppløses på en ryddig måte

6

Dersom cellen går videre med feil i DNA-tråden kan det medføre mutasjon, tap av funksjonalitet eller celledød (nekrose).

Det finnes hovedsakelig tre steder i cellesyklus der sjekkpunkter finnes:

 G1/S sjekkpunktet

 S-fase sjekkpunktet

 G2/M sjekkpunktet

Figur 1-3 Skjematisk oversikt over cellesyklusens kontrollsystem. Figuren viser de

forskjellige CDK som må aktiveres for fremgang i cellesyklusen ved forskjellige sjekkpunkt bildet er hentet fra (Alberts et al., 2015) kapittel 17.

2.1.3 G

/S sjekkpunktet

DNA-skader medfører aktivering av ATM eller ATR¹¹ kinaser i G₁-sjekkpunktet.

Tidligere studier har vist at ATR primært aktiveres som en respons til ultrafiolett stråling, mens ATM primært aktiveres som følge av ioniserende stråling, selv om ATR også kan aktiveres av ioniserende stråling (Stark & Taylor, 2004).

ATM/ATR aktiverer Chk1/Chk2 som initierer fosforyleringen av p53 som bryter p53-Mdm2 bindingen. Dermed dannes det stabil og aktiv p53 som er en tumorsuppressor. Mdm2 (Mouse double minute 2 homolog) inaktiverer p53 ved å binde seg på p53.

11 ATM er Aaxia-telangiectiasia mutated og ATR er Aaxia telangiectasia and Rad3 related

7 Figur 1-4 Et diagram som illustrerer hvordan ATM/ATR stanser cellesyklus ved oppdagelse av DNA-skade i de forskjellige cellesyklusfaser. Bildet er hentet fra (Council, 2006).

p53 initierer produksjon av p21 som er en CKI. p21 binder seg på G1/S-CDK og stopper dens funksjonalitet. Da stopper cellesyklus før DNA-syntesen begynner. (se figur 1-5)

8

Figur 1-5 Illustrasjon av de forskjellige mekanismer som til slutt inaktiverer G1/S-Cdk og stopper cellesyklus ved oppdagelse av DNA-skade. Bildet er hentet fra kapittel 17 i (Alberts et al., 2015).

2.1.4 G

sjekkpunktet

G2/M sjekkpunktet sjekker for DNA-skader før selve celledelingen skjer. Ved oppdagelse av skader stoppes cellesyklus før mitoseprosessen initieres. Siden dette sjekkpunktet verifiserer at DNA er intakt etter syntesen, oppdager den stråleskader. Derfor er G₂/M sjekkpunktet viktig for å motvirke stråleskader på celler og kroppen.

Syklin B/CDK1 komplekset initierer overgangen til mitose fra G2. Syklin B/CDK1 komplekset aktiveres ved defosforylering som utføres av fosfatasen av Cdc25. Derfor vil inaktivering av Cdc25 medføre at cellesyklusen ved G₂/M overgangen blir stoppet.

Ved oppdagelse av DNA-skader i G₂/M aktiveres ATM eller ATR. ATM/ATR er kinaser som aktiverer Chk1/Chk2 som i sin tur inaktiverer Cdc25. Dette stopper aktivering av syklin B/CDK1 komplekset og dermed arresterer cellesyklus i G2/M. (se figur 1-4)

Det som er beskrevet her er en forenkling. Andre faktorer kan ha påvirkning på denne kjeden.

Det er mye som ikke er oppdaget når det gjelder cellenes kontrollmekanismer.

9

2.2 Effekten av ioniserende stråling på celler

Ioniserende stråling er en stråling som kan ionisere molekyler. I cellebiologi er skader påført DNA-tråden som følge av ioniserende stråling av interesse. Ioniserende stråling kan bestå av partikler, som α- og β-stråling, eller av fotoner, som γ-, røntgen- og høyenergetisk ultrafiolett stråling.

2.2.1 Direkte- og indirekte effekter av ioniserende stråling

Ioniserende stråling kan skade DNA enten direkte eller indirekte. Direkte ionisering skjer når strålingen avsetter energi direkte i DNA-molekylet. Indirekte effekter oppstår når strålingen reagerer med andre molekyler i cellen (typisk vann) og danner strålingsinduserte radikaler i cellen. Disse radikaler kan reagere med DNA og danne en biomolekyl radikal som kan føre til at DNA-tråden blir brutt.

For at direkte ionisering skal skje, må strålingen reagere direkte med ett eller flere elektroner i DNA-molekylet. DNA-molekylet er en liten målskive i forhold til hele cellen. For direkte ionisering vil en ladd partikkel, for eksempel α-, β- eller protonstråling, ha større

sannsynlighet for å reagere med et elektron i DNA-tråden. Stråling med høy LET (Linear Energy Transfer)¹² vil også ha større sannsynlighet til å ionisere DNA direkte. Både α- og nøytronstråling har høy LET.

Dersom strålingen avsetter energien over en lang strekning, er det mer sannsynlig å

vekselvirke med molekyler som ikke er i DNA-tråden og danne frie radikaler. Frie radikaler er molekyler eller atomer med et uparet elektron. Frie radikaler dannet nær DNA er stabile nok for å kunne nå DNA og reagere med det. Ett eksempel på frie radikaler er hydroksyl, OH·, som er et datterprodukt av ionisert vann.

Skaden på DNA kan skje enten ved brudd i kun én tråd som betegnes som et SSB (Singel Strand Break) eller ved brudd i begge trådene som betegnes som et DSB (Double Strand Break).

DSB kan skje både som to ionisasjoner etter hverandre som er nærme hverandre eller som en dobbel ionisasjon av DNA-tråden.

2.2.2 Dose og doserate

Strålingen utfører arbeid på molekyler ved å avsette energi i materien som blir bestrålt. Dette arbeidet kan uttrykkes som energi avsatt per kg av materie. Denne energien betegnes som absorbert dose og har enheten Gy = [_𝐾𝑔^𝐽 ].

12 LET viser hvor tett energien til strålingen avsettes i en materie og har enheten [J/m] eller [eV/Å]

10

Avsatt dose over tid kalles for doserate og måles som Gy/h. Ved høy doserate (HDR) vil det ta kortere tid for å avsette samme mengde energi enn ved lav doserate(LDR).

Doseraten påvirker celleoverlevelsesfraksjonen. Høyere doserater vil minske celleoverlevelsen.

2.3 Reparasjonsmekanismer

Effektive reparasjonsmekanismer er viktige for å bevare DNAs funksjonalitet. Uten reparasjonsmekanismer vil cellens DNA ikke engang kunne bli replikert.

Omfanget av DNA-skader på grunn av replikasjonsmekanismer er overveldende. Tabell 5-3 (side 267, 6th edition) i boka «Molecular Biology of The Cell» (Alberts et al., 2015) gir uttrykk på antall reparerte DNA-skader i løpet av 24 timer. I løpet av 24 timer vil cellen reparerer over tjue tusen skader oppstått som følge av replikasjon. Tallene inkluderer ikke skader som følge av eksterne kilder.

Som det er nevnt i kapittel 2.1.2, stoppes cellesyklus i bestemte sjekkpunkter ved oppdagelse av DNA-skader. Forskjellige kinaser initierer cellesyklusarrest slik at cellenes

reparasjonsmekanismer får tid til å virke. Det finnes indikasjoner på en kobling mellom hvilken reparasjonsmekanisme som starter og hvilke kinaser som stopper cellesyklus.

DNA-skader deles generelt i to hovedgrupper:

 SSB (Singel strand break, enkelt trådbrudd)

 DSB (Double strand break, dobbelt trådbrudd)

2.3.1 Reparasjon av SSB

Mammalske celler har flere reparasjonsmekanismer. Ved enkelttrådbrudd i DNA brukes den uskadde tråden som templat for å fullføre den skadde tråden.

Noen av de kjente reparasjonsmekanismene i denne kategorien er baseeksisjonsreparasjon (BER), nukleotideksisjonsreparasjon (NER) og mismatch reparasjon.

SSB-skader kan repareres uten tap av genetisk informasjon. Derfor vil denne typen skade ikke påvirke celleoverlevelsesfraksjonen eller mutasjon i stor grad, dersom reparasjonen skjer rask nok.

To SSB-skader som er nær hverandre kan gi opphav til ett DSB. Derfor er det viktig at SSB- skader repareres rask nok for å unngå mutasjon eller celledød. Forekomsten av DSB som følge av to enkle SSB er avhengig av doseraten. Ved HDR er det større sannsynlighet for at den andre DNA-tråden blir skadet før den første SSB blir reparert.

11

2.3.2 Reparasjon av DSB

Ved dobbel tråd-brudd (DSB), vil DNA-tråden bli brutt slik at to deler av DNA kan separeres.

Om DSB oppstår i G1-fasen, før replikasjonen, finnes det ingen uskadd templat tilgjengelig som kan brukes som mal til å reparere den skadde delen av DNA ved

rekominasjonsreparasjon.

I mammalske celler vil reparasjonsmekanismer som ikke-homolog endeskjøting (NHEJ/

nonhomologous endjoining) og homolog rekombinasjons reparasjon dominere. Homolog rekombinasjon som kan gjøres etter replikasjonen, dvs i G2, benytter den foreliggende kopien av kromosomet, som mal. Denne reparasjonsmekanismen øker sjansen for videreføring av intakt DNA til datterceller. Men den krever tid og kan ikke gjennomføres i mitosen.

Reparasjonsmekanismer av DSB med ikke-homolog endeskjøting er mer komplekse og mer utsatt for feil/mutasjon.

Hvis skadene er for kompliserte for reparasjon, vil cellen ofte gå i apoptose i stedet for å reparere. Denne konservative tilnærming til reparasjon og celledeling er fordelaktig for mammalske celler der bevaring av hele organer er viktigere enn den enkelte celles overlevelse.

For bakterier er celleoverlevelse viktigere og derfor kan reparasjonsmekanismer som er raskere og mer utsatt til feil også brukes. Ett eksempel på denne typen reparasjon er

microhomology-mediated endjoining (MMEJ), der DNA kuttes til å produsere to matchende ender som kan sveises sammen. Denne mekanismen medfører tap av genetisk informasjon.

2.4 Celleoverlevelse og LQ-modellen

Erfaring har vist at noen strålingsinduserte skader i cellene ikke er dødelige (letale) i seg selv, men at de kan gi opphav til dødelige skader dersom flere slike ikke-dødelige (eller subletale) skader får anledning til å samvirke. Det er også vist at noen skader er dødelige dersom man forhindrer cellen i å reparere dem, men at de egentlig bare er potensielt dødelige fordi cellene med stor nøyaktighet kan reparere dem dersom cellen gis tid nok til slik reparasjon. Men noen skader er også av en slik art at cellen ikke har mulighet for å reparere dem. Disse betegnes som dødelige.

DNA-skader kan følgelig deles i tre grupper:

 Ikke-dødelige skader

 Dødelige skader

12

 Potensielt dødelige skader

Denne klassifiseringen av DNA-skader er uavhengig av kilden til skaden. Generelt kan SSB regnes som ikke-dødelige skader, siden skaden kan repareres uten potensiell tap av genetisk informasjon. Men SSB kan bli potensielt dødelig skade ved HDR.

DSB regnes som potensielt dødelig eller dødelig avhengig av når DSB skjer. For eksempel i G2 vil homolog rekombinasjons reparasjon, sørge for stor potensiale for celleoverlevelse mens en DSB i mitosen høyst sannsynlig medfører celledød.

En celle med mutert DNA kan fortsatt fungere og overleve dersom denne mutasjonen forekommer i en inaktiv del av DNA-tråden.

Som vi ser, er celleoverlevelsen etter bestråling med ioniserende stråling avhengig av mange faktorer. Denne kompleksiteten gjør at en ren matematisk tilnærming til modellering av celleoverlevelsesfraksjonen er umulig. Derfor brukes en semi-empirisk tilnærming for modellering av celleoverlevelsesfraksjonen.

En slik semi-empirisk modell er LQ-modellen¹³ (Douglas & Fowler, 1972). I LQ-modellen, separeres celleinaktivering i to grupper. Celler som inaktiveres av to SSB-er og celler som inaktiveres av en DSB.

En DSB vil være resultat av en strålings-partikkel. Derfor vil antall DSB-er være proporsjonal med strålingsdosen. Men to SSB-er er produkt av to strålings partikler. Dermed er

sannsynligheten for celleinaktivering som følge av to SSB-er proporsjonalt med kvadratet av dosen.

LQ-modellen har formen:

𝑆 = 𝑒^{−𝛼𝐷−𝛽𝐷2}

LQ-modellen har en eksponentiell form og bruker to proporsjonalitetskonstanter, α og β.

Disse konstantene finner vi ved kurvetilpasning av LQ-modellen til eksperimentelle data. α og β kompenserer for alle faktorer som bidrar til celleinaktiveringen.

2.5 Stråleresistens

Stråleresistens er et mål på sannsynligheten for at cellen kan overleve en stråledose eller ikke.

Stråleresistens er avhengig av hvor effektivt cellen kan reparere DNA-skader etter bestråling.

Stråleresistens varierer ut fra når i cellesyklus bestrålingen skjer. For eksempel celler i G1, G₂ eller sent S har høy stråleresistens mens celler i tidlig S eller i mitose har lav

stråleresistens.

13 Linear Quadratic model, Lineær-kvadratisk modell

13 Siden cellens stråleresistens er avhengig av cellens evne til å reparere DNA, vil cellens

stråleresistens også være avhengig av cellens evne til å initiere cellesyklusstopp.

2.5.1 Hypersensitivitet (HRS/Hyper Radio Sensitivity)

Tidlige funn har vist at enkelte celletyper etter bestråling med små stråledoser (mindre enn 0,5 Gy), har lavere overlevelse enn den forventede verdien utfra LQ-modellen (Marples & Joiner, 1993). Etter den initielle lave overlevelsen følger et doseområde med økt stråleresistens (IRR- induced radioresistance). Dette fenomenet vises i figur 1-6 sammen med HRS.

Figur 1-6 En eksempel på hypersensitivitet (HRS) i 0-0,3 Gy stråledoseområdet, og indusert stråleresistens (IRR) i 0,5-1 Gy stråledoseområdet. (personlig kommunikasjon Nina J. Edin)

Dette fenomenet ble kalt for lav dose hypersensitivitet (HRS) og har blitt påvist i over 40 humane cellelinjer(Marples, 2004). HRS har også blitt observert in vivo i nyre fra mus og i normale humane hudceller (Joiner & Johns, 1988; Turesson & Joiner, 1996) Senere studier har påpekt en sammenheng mellom HRS og manglende induksjon av det tidlige G₂

sjekkpunktet, som induseres umiddelbart etter bestråling. Det varer bare 2-4 timer og arresterer derfor kun celler, som var i G2 (eller nær G2) på bestrålingstidspunktet. Dette sjekkpunktet blir bare indusert når antallet DSBs og dermed dosen er stor nok (~0,3 Gy avhengig av cellelinje og bestrålingsmodalitet) (Marples, Wouters, Collis, Chalmers, &

Joiner, 2004).

HRS forekommer i de fleste cellelinjer og regnes som normalrespons for celler i proliferasjon.

14

2.5.2 TGF-β3, The Growth Factor β3

TGF-β3 (transforming growth factor-beta 3) er et cytokin. Et cytokin er et protein som beveger seg mellom cellene og lar dem kommunisere med hverandre. TGF-β3 er en av tre isoformer, hvorav TGF-β1 er mest kjent og studert. Alle TGF-β isoformer blir syntetisert sammen med et tilhørende protein kalt LAP (latency-associated protein). LAP er kovalent bundet til TGF-β, men bindingen kan løses av furin-liknende enzymer. Etter prosesseringen forblir TGF-β ikke-kovalent bundet til LAP i en ikke aktiv tilstand. (Annes, Munger, &

Rifkin, 2003) Aktiveringen foregår ved at TGF-β løses fra LAP enten ved eksponering for høy eller lav pH, varme eller ioniserende stråling (Ehrhart, Segarini, Tsang, Carroll, &

Barcellos-Hoff, 1997).

TGF-β3 er involvert i celledifferensiering, embryogenese og fosterutvikling. Mus uten TGF- β3 dør innen 20 timer etter fødselen på grunn av forsinket utvikling av lunger og ganespalte, som gjør at de mister evnen til å die (Kaartinen et al., 1995). Det er vist at TGF-β3 stimulerer differensiering av mesenchymale stamceller (Guo et al., 2010) og at TGF-β3 forhindrer arrdannelse (Durani, Occleston, O'Kane, & Ferguson, 2008).

Mus bestrålt med 20 Gy i thorax fikk mindre lungefibrose etter ukentlige behandlinger med TGF-β3 etter bestrålingen. (Xu et al., 2014) I tillegg er det vist at TGF-β3 beskytter tarm- stamceller hos mus mot store stråledose (12-16 Gy) (Booth, Haley, Bruskin, & Potten, 2000).

2.5.3 HRS, TGF- β3 og NO

Tidligere forskning i vår forskningsgruppe har vist at en prebestråling med 0,3 Gy kan fjerne HRS. Når prebestrålingen ble gitt med høy doserate varte effekten noen timer, men ble den gitt med en lav doserate på 0,3 Gy/t (i det følgende kallet LDR) var virkningen permanent.

Medium fra LDR bestrålte celler kunne overføres til ubestrålte celler, som da mistet HRS ved påfølgende testbestråling. Overraskende kunne medium fra ubestrålte celler også bestråles med LDR uten celler tilstede og fjerne HRS i celler som ble eksponert for det bestrålte

medium. Effekten avhang av at det var serum i mediet mens det ble kondisjonert på ubestrålte celler (N. J. Edin et al., 2009).

Senere forskning viste at det er interleukin-13 i serum, som er nødvendig for effekten (N. F.

Edin, 2014). Rollen til interleukin-13 er å indusere nitrogen-oksid syntase (iNOS, inducible nitric oxide synthase) og pro-aktivere den aktive faktoren gjennom å aktivere et furin-

liknende enzym (se kapittel 2.5.2). Den aktive faktoren som er involvert i fjerning av HRS ble identifisert som TGF-β3 (N. J. Edin et al., 2014). Rollen til iNOS er å produsere NO

(nitrogen-oksid), som reagerer med superoksid og danner peroksinitritt, ONOO^-. Peroksinitritt ble funnet til å være involvert både i aktivering av TGF- β3 og i opprettholdelsen av

fenotypen uten HRS ved å forhindre reassociering av TGF- β3 med LAP etter bestråling, fordi

15 peroksinitritt binder seg til LAP (N. J. Edin et al., 2014; N. J. Edin et al., 2013). Dette er oppsummert i figur 1-7.

Det er mulig NO/peroksinitritt også er involvert når TGF- β3 reagerer med reseptoren på cellemembranen. Forsøk har vist at inhibering av iNOS samtidig med tilsetting av TGF- β3 til celler forhindret effekten av TGF- β3 (upubliserte data, Nina Jeppesen Edin). I denne

oppgaven undersøkes om ekstra NO/peroksinitritt kan øke effekten av TGF- β3.

Figur 1-7 En oppsummering av sammenhengen mellom TGF- β3, NO og peroksinitrittt i forbindelse med effekten av lav doserate prebestråling på HRS. Hvordan TGF- β3 fjerner HRS vet man ikke. (Figuren er hentet fra personlig kommunikasjon med Nina Jeppesen Edin)

16

3 Materialer og metoder

3.1 Generelt om koloniteknikken

For å vurdere cellenes overlevelse etter en gitt testdose, måler vi hvilken fraksjon av cellene som har beholdt evnen til å danne en koloni etter bestrålingen. Vi sår da ut et bestemt antall celler i en cellekulturflaske og lar cellene feste seg til flaskebunnen (16 – 18 timer) før testdosen gis.

Etter bestrålingen blir cellene inkubert i 12-22 dager avhengig av dose, celletype og celleantall utsådd på flasken. Cellene fikseres når de har dannet store kolonier som er klart synlige med det blotte øye. Etter denne perioden fikseres cellene og antall kolonier som er dannet telles. Kolonier med flere enn 50 celler telles med.

I spesifikke eksperimenter kan cellene manipuleres før eller etter bestråling. Manipulasjonen kan være tilsetting av bestemte molekyler/kjemikalier/proteiner til mediet, utsette cellene for hypoksi eller andre manipulasjoner.

3.2 Cellelinje

I denne oppgaven er celler fra den etablerte humane cellelinjen T-47D studert. T-47D-cellene ble ekstrahert, etablert og karakterisert i 1978 av I. Keydar. (Keydar et al., 1979)

T-47D-celler er epiteloide celler fra brystvevet. Som mange andre kommersielle cellelinjer som brukes i forskning, uttrykker T-47D-celler telomerase som regenererer telomeren og dermed åpner muligheten for ubegrenset med antall celledelinger.

T-47D-celler uttrykker villtypen av pRb-genet (dvs. proteinet som kodes av Retinoblastoma genet) mens den har defekt p53-funksjon (Casey, Lo-Hsueh, Lopez, Vogelstein, &

Stanbridge, 1991).

T-47D har vist hypersensitivitet overfor små stråledoser. I vår gruppe har vi arbeidet med denne cellelinjen og har mye erfaring med arbeidet med denne cellelinjen(Nina Jeppesen Edin et al., 2009; Åmellem, 1997).

Det er i tillegg brukt celler fra en klonet sub-linje av T-47D som kalles T-47Dsc2

-celler. Denne sub-linjen representerer etterkommere av villtype T-47D-celler som overlevde virkning av variabel hypoksi og langtidsbestråling ved lave doserater. Ved DNA-flowcytometrisk analyse viste det seg at de overlevende cellene hadde to distinkte sub-linjer. Hver sub-linje hadde forskjellig mengde DNA.

14 «Colony assay method»

17 Cellene fra den ene sub-linje har dobbelt så mye DNA som en celle fra villtypen T-47D.

Cellene ble klonet slik at man fikk rendyrkede linjer representert fra de to sub-gruppene hver for seg. Den klonen som ble studert i denne oppgaven, og som hadde dobbelt DNA-mengde, ble kalt for T-47DsC2

(Stine Gyland Mikalsen, 2016).

T-47D_s^c2-celler har blitt dyrket uten bestråling og i vanlig CO₂-inkubator og studert videre i vår gruppe som en del av forskningen om virkning av hypoksi og langtidsbestråling ved lave doserater på T-47D-celler.

3.3 Utstyr

3.3.1 Cellekultiveringsutstyr

Villtypen av T-47D-cellene som ble benyttet i dette prosjektet ble anskaffet nylig fra

«American Type Culture Collection» (ATCC). (http://www.lgcstandards-

atcc.org/Products/All/HTB-133.aspx) Cellene hadde en doblingstid på ca. 37 timer da eksperimentene ble gjennomført.

T-47DsC2

(celler som ble brukt til senere eksperimenter) har også en doblingstid på ca. 37 timer.

Cellene omsettes rutinemessig til nye flasker på mandager og fredager med mediumskifte på onsdager. Cellenes vekstrate holdes dermed på den eksponentielle delen av cellevekstkurven.

(se figur 3-1)

Cellelinjen vedlikeholdes av labansvarlige i henhold til laboratoriets protokoller.

Til mine eksperimenter, fikk jeg en eller flere flasker med celler klar til bruk fra labansvarlig.

Cellene dekket da 70-90 % av flaskebunnen. Dette tilsvarer 3-5 millioner celler.

Alle celler dyrkes i Nunc™ Cell Culture Treated EasYFlasks™ V/C (Vent/Close) flasker med 25 cm² flaskebunnoverflate¹⁵. Disse flaskers kork kan skrus til «Vent» som lar flasken

akklimatisere/utveksle gasser med omgivelsen, gjennom diffusjon. Det minimaliserer kontaminasjonsfaren sammenlignet med åpne flaskekorker.

Cellene dyrkes i RPMI-1640 medium (Rosewell Parks Memorial Institute) som er tilsatt 10%

føtalt kalveserum (Fetal Bovine Serum, FBS) og insulin (150-200 enheter per mL).

Mediet er tilsatt insulin for å hjelpe T-47D-celler med sukkerinntaket (Vivi Kielberg, 2001).

Labansvarlig fremstiller RPMI til bruk i laboratoriet fra pulver.

I denne teksten referer vi til mediet som er fremstilt på vårt laboratorium som RPMI.

15 Også kalt T25 flaske

18

Figur 3-1 Illustrasjon av cellekulturers vekst som funksjon av tid etter såing¹⁶.

Fenolrødt brukes som pH-verdi indikator i RPMI. Den betegnes også som PSP

(Phenolsulfonphthalein). Den har et indikasjonsområde på 6,8 til 8,2. Fenolrødt forandrer farge fra rødt, ved høye pH-verdier, til gult, ved lave pH-verdier. Fenolrødt kan ha en østrogen-liknende effekt på noen celletyper, spesielt celler fra bryst som T-47D(Welshons, Wolf, Murphy, & Jordan, 1988). Selv om østrogen-liknende effekten av fenolrødt er liten hos T-47D-celler, bruker vi RPMI-løsning med mindre mengde fenol rødt enn standard RPMI- 1640.

Cellene inkuberes i en av to CO₂-inkubatorer i vårt laboratorium. De to inkubatorene er av typene Forma Steri-Cult CO2 inkubator, fra Thermo Scientific, og Steri-Cult 200 inkubator, fra Forma Scientific.

Inkubatorene holder atmosfærisk gassblanding men med 5% CO2. Inkubatorene opererer med en temperatur på 37^oC og 85% relativ fuktighet. CO₂ er tilsatt for å fungere sammen med bufferen (natriumbikarbonat, NaHCO₃) i RPMI for å holde RPMIs pH-verdi til ca. 7,2-7,4.

16 Bildet er hentet fra http://homepages.gac.edu/~cellab/chpts/chpt12/figure12-2.html

19 For å løsne cellene fra flaskebunnen samt separere dem fra hverandre, bruker vi en Trypsin- EDTA-løsning (Ethylenediaminetetraacetic acid) fra Lonza.

Trypsin er medlem av serinprotease-familien. Den kløyver peptider på COOH-enden av Lysin eller Arginin. Trypsins funksjon blir hemmet av proteiner som er i føtal kalveserum. Ionene Mg²⁺ og Ca²⁺ kan også hemme trypsins enzymatiske funksjon. Denne effekten benytter vi for å stoppe trypsineringsprosessen.

EDTA er tilsatt trypsin-løsningen som et chelat som virker på kalsiumholdige festemolekyler (Adhesion molecules) (SigmaAldrich).

Trypsin-EDTA-løsningen varmes opp i et vann-bad ved 37^o C som er optimal temperatur for celleseparasjon.

For å undersøke celler i dyrkingsflasker, bruker vi et «Nikon TMS» invertert mikroskop.

Mikroskopet har toppbelysning og et fase-ringfilter. Vi bruker et invertert mikroskop for å undersøke celler som er festet til flaskebunnen.

3.3.2 Bestrålingsutstyr

Bestrålingen ble gjennomført på Bestrålings-laboratoriet (KV08, Kjemibygningen).

Cellene ble satt i en «walk in-»inkubator som er ved siden av røntgenrommet. Inkubatoren holder 37,5 ^o C og vanlig atmosfærisk gass uten tilsatt CO2.

For bestråling av cellene har vi brukt et røntgenapparat av typen Pantak Terapax HF 225. For mine eksperimenter brukte jeg en 0,5 mm kobberplate som filter. Røntgenmaskinen ble kjørt med 220 kV spenning og 10 mA strøm.

Cellene ble plassert i et stålkammer som er vist i figur 3-2. Stålkammeret oppbevares i «walk in» inkubator for å holdes ved 37 ^o C. Dette kammeret ble satt inn i bestrålingskammeret rett før bestrålingen startet.

Figur 3-2 Skjematisk bilde av oppsett av celleflasker i stålkammeret til bestråling.

20

Cellene ble bestrålt med en doserate på 0,5 Gy/min med dette oppsettet. Strålefeltet kan regnes som uniformt for våre eksperimenter.

Strålingskammerets bunn er utstyrt med vannrør. Vannrøret er koblet til et varmtvannbad.

Vannet holder 39^oC hvilket sikrer en temperatur på 37 ^o C i flaskene. På denne måten unngår vi nedkjøling av cellene under bestrålingen.

3.3.3 Fikseringsutstyr

For å fiksere og farge kolonier bruker vi PBS, 99% industrielt alkohol og metylenblått.

PBS(Phosphate Buffered Saline)løsningen som er bufret til å ha pH 7,3-7,5 (Lonza,

http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/buffered- saline/pbs-without-ca-mg-or-phenol-red.aspx) brukes til å fjerne/vaske vekk rester av RPMI- proteiner som kan hindre virkningen av trypsin. PBS-løsningen inneholder ikke Ca, Na eller phenol red og hindrer ikke selv virkningen av trypsin. Derfor kan PBS også brukes i

trypsineringsprosessen.

PBS som brukes til våre eksperimenter er enten ferdigblandete PBS-løsning eller løsning som er fremstilt av 10X konsentrat på laboratoriet.

Vi bruker industrielt methylert sprit, teknisk alkohol, med 99% alkohol (95% metanol og 4%

etanol) til å fiksere koloniene.

For å farge koloniene bruker vi metylenblått (C16H18N3SCl) som fester seg på makro-

molekyler, som RNA og andre store proteiner, og dermed farger koloniene blå. Metylenblått kan brukes til å farge mammalske celler etter at de er fiksert. Celleveggen er ikke permeabel for metylenblått før cellene er fiksert. Derfor blir ikke friske celler med intakte cellevegg farget av metylenblått.

3.3.4 Plottings- og analyseutstyr

En teller med bakgrunnsbelysning og forstørrelsesglass ble brukt for å telle kolonier (Gerber Intruments).

For å beregne overlevelsesfraksjonen og usikkerheten for hvert eksperiment ble Mirosoft Excel 2010 ble brukt. De nødvendige analyse-ligninger ble skrevet inn i Excel. (Se kapittel 2.6 Om analyse-ligninger) Excel brukes også for å regne ut gjennomsnittsverdier for ett sett av eksperimenter.

Dataplotting og kurvetilpasning ble gjennomført i Origin 8.5.

3.4 Sterilitet og kontaminasjon

21 Alt utstyr som ble brukt til arbeid med celler var sterilt. Flerbruksutstyr som Glassflasker, kolber og lignende ble sterilisert enten i tørrsterilisator (minst 160^oC i minst 2 timer) eller i autoklav.

Engangsutstyr, som pipetter, celleflasker og reagensrør, er sterilisert av produsenten og forseglet til transport og oppbevaring. Disse ble åpnet i LAF-benken for å unngå luftbåren kontaminasjon.

Arbeidet med celler ble utført i en klasse II LAF-benk (Laminar Air flow). LAF-benken bruker luftsirkulasjonen som en hindring for luftbårenkontaminasjon. Luften blir pumpet gjennom et HEPA-filter (high efficiency particulate arresting) og gjennom åpninger som lar luften strømme nedover som laminær luftstrøm. Luften blir da resirkulert gjennom åpninger i bunnen. Det gjør at luftbåren kontaminasjon blir sug inn i ventilasjonen og filtrert før den når vårt sterile arbeidsutstyr. (se figur 3-3)

Figur 3-3 Skjematisk figur av en LAF-benk med vertikal luftstrøm.¹⁷

Under arbeidet med celler, brukte jeg latekshansker for å unngå kontaminering av cellene.

Hanskene ble sprayet med alkoholløsning (75% etanol) som fordampet før de kom i kontakt med celler eller andre sterile utstyr.

Arbeidsflatene ble sprayet med alkoholløsning (70%) og tørkes med en klut før og etter arbeidet med celler.

17 Figuren er hentet fra: http://www.laminarflowbench.com/images/Vertical%20Laminar%20Flow_Diagram.JPG

22

RPMI-flaskens kork ble flammesterilisert før åpning av flasken hver gang. Flaskens tut og kork ble flammesterilisert før korken ble skrudd fast.

I eksperimenter der ikke-sterile løsninger ble brukt, filtrertes løsningen gjennom en 0,2 μm filter for å fjerne eventuelle kontaminatorer.

3.5 Eksperimentgjennomføring (Protokoll)

Eksperimentene ble gjennomført med tre forskjellige fremgangsmåter på de to forskjellige cellelinjene¹⁸. Forskjellen mellom de tre fremgangsmetodene går på om vi utsatte cellene for et modifisert medium eller ikke og om cellene ble utsatt for det modifiserte mediet før eller etter testdosen.

i. Ett sett med eksperimenter ble gjort uten å forandre cellemediet. Disse ble gjennomført for å få en doseresponskurve for cellelinjen T-47D.

ii. I neste sett med eksperimenter ble mediet i celleflasker skiftet med modifisert medium 24 timer etter at testdosen var gitt. Disse eksperimentene ble gjennomført på T-47D- celler.

iii. I neste sett med eksperimenter ble mediet i moderflasker skiftet med medium som var modifisert en dag før trypsinering og seeding ble gjennomført. T-47D-celler testet med denne fremgangsmetoden.

iv. Repetisjon av tredje sett med eksperimenter på T-47DsC2

- celler

3.5.1

Fem forsøk ble gjort for denne delen for å få dosereponskurven for T-47D-celler. Disse eksperimentene var også ment for å trene på å gjennomføre slike eksperimenter. En oversikt over de forskjellige steg i eksperimentet er nevnt i begynnelse av kapittelet. Men vi går vi gjennom hvert steg mer detaljert her.

Noen timer før trypsineringen ble et passende antall T25 flasker fylt med 4 ml RPMI som var forvarmet i ett vannbad i ca. 15 minutter. Flaskene ble satt i inkubator for å akklimatisere og få riktig pH-verdi i mediet.

Jeg brukte 10 flasker som kontrollflasker, 5 flasker for hver testdose og en flaske for å sjekke multiplisitet.

Trypsineringen ble innledet med å tømme ut moderflaskens medium. Deretter tilsattes 2 ml trypsinløsning for å nøytralisere gjenværende RPMIs trypsin-inhibitor, dvs. serumproteinet.

De to ml trypsinløsning ble fjernet og 3 ml frisk trypsinløsning tilsatt. Flasken ble satt i inkubator i 3 – 7 minutter til cellene løsnet fra flaskebunnen. En 5 ml sprøyte med en 2 mm nål ble brukt til å separere cellene fra hverandre.

Når cellene var separert og enkeltceller var suspendert i trypsinløsning, overførtes flaskens

18 T-47D og T-47D_s^C2 -cellelinjer

23 innhold til et reagensrør. Røret ble satt i en sentrifuge og suspensjonen sentrifugerte ved 1100 rpm (revolutions per minute), i 5 minutter. Cellene var da samlet i en pellet i bunnen av røret.

Trypsinløsningen ble fjernet og tilsetter 5 – 8 ml RPMI, avhengig av hvor mange celler moderflasken hadde, ble tilsatt. Cellene ble resuspendert i mediet med en 2 ml pipette. 0,5 ml av denne suspensjonen ble overført til ett nytt reagensrør som inneholdt 4,5 ml RPMI.

Under både resuspensjon og celleseparasjon er det viktig å unngå at for mange celler dør eller sprekker. Sprukne celler virker som lim i suspensjonen. Celler kan feste seg til hverandre og rørvegger lettere.

Fra denne uttynnede suspensjonen tok jeg noen dråper i ett Bürker-kammer. I mikroskopet talte jeg antall celler. Dette steget ble gjentatt tre eller flere ganger for å minimalisere

stokastiske variasjonen i celletellingen. Gjennomsnittet av disse tellingene brukes til å regne ut celletettheten i suspensjonene.

Cellesuspensjonen ble deretter fortynnet til suspensjoner med bestemte celletetthet.

Celletettheten korresponderte til forskjellige testdoser. Ved store testdoser (lav overlevelse) brukte vi større celletetthet. Suspensjonenes celletetthet ble justert ut fra resultatet fra tidligere eksperimenter. Blandingsforholdene for hvert eksperiment er gitt i Vedlegg A.

Dose [Gy] 0 - 5 5 8 10 12 - 14

Celletetthet [ml^-1]

200 - 300 500 - 600 4000 10000 -

20000 100000

Tabell 3-1 Celletetthet av suspensjoner til forskjellige testdoser.

Når suspensjonene var klare, ble T25-flaskene tatt ut av inkubatoren og tilsatt 1 ml av den respektive suspensjonen til hver flaske. Suspensjonen som ble brukt hadde samme celletetthet som antall celler som skulle være i hver celleflaske.

Det er viktig å gjennomføre selve utsåingen så rask og så nøyaktig som mulig. Dersom celleflaskene er ute av CO2 inkubatoren for lenge, vil mediets pH-verdi øke og påvirke cellene. Etter at seedingen var gjennomført ble flaskene plassert i inkubatoren.

Etter 16 – 18 timer ble flaskene bestrålt med en bestemt testdose. Denne tiden ga cellene mulighet til å feste seg til flaskebunnen. Lengre ventetid gir cellene tid til å dele seg.

For å korrigere for eventuell celledeling mellom utsåing og bestråling, fikseres og farges en testflaske ved bestrålingstidspunktet. Denne differensial-telles i mikroskop for å bestemme det gjennomsnittlige antallet celler per utsådd kolonidannende enhet (multiplisiteten).

Celleflasker, inkludert kontrollflasker, ble tatt ned til en «walk in»-inkubator som er ved siden av røntgenrommet. Transporttiden er på 1-2 minutter. Flaskekorkene var skrudd fast under hele bestrålingsprosessen, fra transport av flasker til «walk in»-inkubator inntil flaskene blir satt inn i CO2 inkubatoren etter testdosen.

For å unngå cellesyklusarrest under og etter bestrålingsprosedyren, minimalisertes nedkjøling av cellene. Dersom temperaturen faller under 36 ^o C vil cellesyklusen hemmes (Christiansen,

24

2005). Som det er nevnt i kapittel 2.2 vil cellesyklusarrest resultere i økt resistens mot

stråleskader hos cellene. Denne cellesyklusarresten overskygger de prosessene som vi ønsker å undersøke.

Celleflaskene ble fraktet ned i en isopor beholder for å minimalisere varmetapet under transport. Isoporbeholderen varmes opp i «walk in»-inkubatoren før prosedyrene begynner.

Celleflaskene ble satt i et stålkammer og bestråltes. Flasker med lavest testdose bestråltes først. Som nevnt tidligere er doseraten med vårt oppsett 0,5 Gy/min. Bestrålingsvarigheten bestemmer hvilken dose cellene får.

Ved et passende tidspunkt, under bestrålingen, ble multiplisitetsflasken fiksert og farget etter fikseringsprosedyrene.

Etter at bestrålingen var ferdig for alle flasker, ble de tatt opp til LAF-benken. Flaskenes kork ble åpnet for ventilasjon og flaskene ble satt i inkubatoren. Cellene ble inkubert i 2 – 3 uker slik at cellene kunne danne kolonier. I denne perioden ble mediet til flaskene skiftet etter behov. Det vil si at mediet til flasker med høyere antall celler ble skiftet oftere.

Når det var dannet store nok kolonier i flaskene, ble cellene fiksert. Kolonier bør være store nok til å kunne se til telling men ikke så stor at celler begynner å løsne fra flaskebunnen.

Koloniene ble talt og analysert.

For å fiksere flasker, ble RPMI først fjernet fra flasken. Så ble de skyllet med 3 ml PBS. Hver flaske fikk 3 ml teknisk alkohol. Etter 3 – 5 minutter ble alkoholen fjernet og 3 ml metylenblå tilsatt og sto i 3-5 minutter. Flaskene ble skylt, forsiktig med lunkent vann for å fjerne

unødvendig fargepigmenter. Til sist ble flaskene satt til tørking på spesialpapir frem til kolonitelling.

Til kolonitelling brukte jeg telleren¹⁹ sammen med en rød markør. Kolonier som var store nok ble merket med markøren. Hvert trykk fra markøren ble talt av telleren. Kolonier som jeg var ikke sikker på om de var store nok, ble undersøkt under mikroskop. Dersom det er flere enn 50 celler i kolonien ble de tatt med i tellingen.

Etter at alle eksperimenter med en metode var gjennomført, ble gjennomsnittverdier fra de individuelle forsøk beregnet. Ved å samle resultatet fra flere forsøk til en gjennomsnittverdi, minimaliseres de stokastiske feilkilder som finnes.

3.5.2 Andre sett med forsøk

I denne metoden, erstattes mediet i celleflasker med modifiserte medier 24 ±2 timer etter at testdosen var gitt. Ellers var fremgangsmetoden for denne metoden som første sett med eksperimenter.

19 Bakgrunns-belyst teller fra Gerber instruments. Se kapittel 3.3.4!

25 I de første eksperimentene hadde jeg problemer med å resuspendere celler etter

sentrifugeringen. Celler kunne ikke separeres enkelt etter sentrifugering. Det utsatte cellenes vegg for mye stress som medførte celledød.

Derfor stoppet jeg å bruke sentrifugen. I stedet brukte jeg en metode der jeg nøytraliserte trypsin med RPMI direkte i celleflasken etter å ha skylt cellene to ganger med trypsin.

Det modifiserte mediet ble preparert samme dag som medieskiftet. Det var fire medier som ble brukt. Foruten standardmediet, et medium som var tilsatt 0,1 ng/ml TGF-β3. Dette mediet referer jeg som medium «A». Dertil et medium med 0,1 ng/ml TGF-β3 og 0,1 mM DEANO.

Dette mediet kaller jeg for medium «B».

TGF-β3 som jeg brukte var i en løsning på 2 μg/ml. Denne løsningen ble oppbevart i en dypfryser og tinet før bruk. Det samme gjaldt DEANO løsningen, som hadde en

konsentrasjon på 32,2 mM.

Siste medium var en del av medium B som hadde blitt bestrålt med 1 Gy og blir kalt for medium «C».

Medium A, B og C samt standard RPMI ble varmet opp i varmtvann-bad. Deretter ble mediet i celleflaskene skiftet med de modifiserte medier. Etter mediumskiftet, ble cellene inkubert, fiksert og analysert som det første sett med eksperimenter. Ved senere mediumskifte ble vanlig RPMI brukt på alle flaskene.

3.5.3 Tredje og fjerde sett med forsøk

I de siste eksperimentene som ble gjennomført ble cellenes medium erstattet, 24 timer før trypsinering, med medium A, B, C og RPMI.

For disse eksperimenter ble 4 moderflasker brukt, en til hvert medium. Medium A, B og C ble preparert med samme blandingsforhold som i andre sett med eksperimenter.

Både T-47DsC2

og T47-D celler ble undersøkt med denne metoden.

3.6 Matematisk analyse av eksperimentelle data

3.6.1 Utregning av overlevelsesfraksjonen

Det er mange faktorer som bidrar til om en koloni dannes eller ikke. Vi trenger matematiske verktøy som kan hjelpe oss med å skille ut de celledødsfaktorer som vi vil undersøke.

Plating efficiency (PE) sier noe om hvor stor del av sådde celler danner kolonier i

kontrollflasker(testdose er 0 Gy). Plating efficiency er en verdi mellom 0 og 1. Eventuelt kan det gis i prosentform ved å multiplisere PE med 100.

26

𝑃𝐸 = 𝑁(𝐶) 𝑁₀(𝐶)

Der N(C) er antall kolonier som er dannet og 𝑁₀(C) er antall celler som er sådd ut i kontrollflaskene. For å finne plating efficiency for alle flasker summerer vi PE for alle kontrollflasker og deler på antall kontrollflasker.

Vi bruker da plating efficiency til å korrigere antall sådde celler for testflasker. Det betyr ikke at antall celler som er sådd ikke er korrekt. Men at av de sådde celler kan det korrigerte antall celler danne kolonier.

Med dette kan vi regne ut overlevelsesfraksjonen (Surviving Fraction), for forsøksflasker:

𝑆𝐹(𝐵) = 𝑁(𝐵) 𝑁₀(𝐵) × 𝑃𝐸

N₀(B) er antall celler som er sådd i hver flaske og N(B) er antall kolonier i hver flaske.

Vi regner gjennomsnittet for antall kolonier for hvert sett av forsøksflasker (for hver testdose), slik det gjøres for kontrollflasker.

Standardfeil for antall kolonier i hver flaske, N(B), kan regnes ut fra standardavviket for endelig utvalgsstørrelse, = √¹_𝑛(∑^𝑛_𝑖=1𝑋_𝑖− 𝑋)².

𝑆𝐸(𝑁(𝐵)) = √²

𝑛 = √ 1

𝑛(𝑛 − 1)(∑ 𝑋_𝑖 − 𝑋)

𝑛

𝑖=1

2

n er antall flasker for hver testdose, Xi er antall kolonier i flaske «i» og 𝑋 er gjennomsnittverdien av kolonier for alle flasker for en testdose.

Vi kan regne ut standardfeilen for overlevelsesfraksjonen, SF(B), på samme måte som for standardfeilen for antall kolonier for hver testdose. Men overlevelsesfraksjonen er avhengig av både antall kolonier og antall sådde celler. Det betyr at standardfeilen må inkludere disse to variabler. Vi har allerede regnet ut standardfeilen for N(B).

Standardfeil for antall sådde celler (N0(B)) gis fra standardfeilen i antall kolonier for kontrollflasker.

𝑆𝐸(𝑁₀(𝐵)) = 𝑆𝐸(𝑁(𝐶))

Grunnen til det er at antall kolonier i kontrollflasker reflekterer antall sådde celler uten påvirkning av en testdose eller andre kjemiske behandlinger.

Med dette kan vi regne ut standardfeilen for overlevelsesfraksjonen, SE(SF(B)):

27 𝑆𝐸(𝑆𝐹(𝐵)) = √((𝛿𝑆𝐹(𝐵)

𝛿𝑁₀(𝐵)𝑆𝐸(𝑁₀(𝐵))²+ (𝛿𝑆𝐹(𝐵)

𝛿𝑁(𝐵) 𝑆𝐸(𝑁(𝐵))²)

= √((−𝑁

𝑁₀² 𝑆𝐸(𝑁₀)²+ (1

𝑁₀𝑆𝐸(𝑁)²)

Det er viktig å nevne at utregninger frem til nå, antar at alle kolonier er dannet fra en enkelt celle.

Denne antagelsen er ikke korrekt. Trypsineringsprosessen ikke produserer 100% enkeltceller.

Enkelte celler deler seg i tiden mellom trypsinering og bestråling. For å korrigere for denne effekten bruker vi «multiplisitet».

3.6.2 Multiplisitet

Multiplisitet er ett tall, større enn 1, som sier noe om hvor mange celler som finnes i en celle- enhet. I multicellede enheter, kan hver av de cellene danne koloni. For å inaktivere en slik enhet, må alle cellene bli inaktivert. Med andre ord multicellede enheter har større

sannsynlighet enn enkeltcellede enheter. Hvis vi antar at andelen av celler som danner koloni er f, blir (1-f) andelen celler som danner ikke kolonier. Hvis det er m celler i en celle-enhet vil sannsynligheten for å ikke danne koloni bli (1-f)^m.

Observert overlevelse, F, for en m-cellede enhet blir:

𝐹 = 1 − (1 − 𝑓)^𝑚

Vi bruker en flaske som er utsådd sammen med resten av forsøket og blir fiksert mens

testdosen ble gitt til de andre flasker, «M-flasken», til å finne multiplisiteten. Vanligvis har vi en M-flaske per moderflaske for hvert eksperiment.

Under mikroskopet teller vi celle-enheter sammen med hvor mange celler hver celle-enhet har. Vi teller til over 200 celle-enheter for hver M-flaske. Da har vi antall singletter, dubletter, tripletter osv. per telling. Fra dette regner vi ut multiplisiteten:

𝑀 = ∑ 𝑥_𝑖

𝑚

𝑖=1

. 𝑖

m er antall celler i en celle-enhet og 𝑥_𝑖 er andelen av celle-enheter med i celler med ∑^𝑚_𝑖=1𝑥_𝑖 = 1.

Usikkerheten i multiplisitet betegnes som ΔM. ΔM finner vi ved å telle multiplisiteten for en flaske flere ganger. Både inhomogen spredning av celle-enheter over flaskearealet og måten en person teller bidrar til ΔM. ΔM er satt til 0,3.

3.6.3 M-korrigert overlevelsesfraksjon, f

28

Korrigert overlevelsesfraksjon for en gruppe celle-enheter, hvor hver celle-enhet kan ha opptil m celler, gis som:

𝑆𝐹 = ∑ 𝑥_𝑖

𝑚

𝑖=1

(1 − (1 − 𝑓)^𝑖)

For en cellegruppe bestående av kun singletter og dubletter, kan vi regne ut andel av celler som danner koloni, f:

𝑓 =𝑀 − √𝑀²− 4(𝑀 − 1)𝑆𝐹 2(𝑀 − 1)

En slik utregning for populasjoner som består av flercellede celle-enheter, m>2, vil bli veldig komplisert. Derfor bruker vi denne ligningen som approksimasjon for våre eksperimenter, selv om vi har celle-enheter med m>2.

I en tidligere oppgave (Lorentzen, 2001) fra vår gruppe ble det vist at avviket mellom denne approksimasjonen og nøyaktig utregning for populasjoner som inkluderer også tripletter er mindre enn 1 %. Ved lave andel av celle-enheter med celletall over 3 celler, kan vi bruke denne approksimasjonen.

Fra siste ligning ser vi at f er SF korrigert for multiplisitet. Vi kan da regne ut standardfeilen for f med samme tilnærming som SF:

𝑆𝐸(𝑓) = √(( 𝛿𝑓

𝛿𝑆𝐹𝑆𝐸(𝑆𝐹))

2

+ (𝛿𝑓 𝛿𝑀∆𝑀)

2

)

𝛿𝑓

𝛿𝑆𝐹 = 1

√𝑀²− 4(𝑀 − 1)𝑆𝐹

𝛿𝑓 𝛿𝑀=

−1 + 𝑀 + 2𝑆𝐹 − 2𝑆𝐹. 𝑀

√𝑀²− 4(𝑀 − 1)𝑆𝐹 2(𝑀 − 1)²

Vi setter inn for _𝛿𝑀^𝛿𝑓 og _𝛿𝑆𝐹^𝛿𝑓 i SE(SF) og får:

𝑆𝐸(𝑓) =

√(

( 𝑆𝐸(𝑆𝐹)

√𝑀²− 4(𝑀 − 1)𝑆𝐹)

2

+ (

−1 + 𝑀 + 2𝑆𝐹 − 2𝑆𝐹. 𝑀

√𝑀² − 4(𝑀 − 1)𝑆𝐹 2(𝑀 − 1)² ∆𝑀

)

2

)

29 Med dette kan vi regne ut både M-korrigert overlevelsesfraksjon, f, og dens standardfeil for hvert sett med flasker i ett forsøk. Disse utregninger er satt i en Excel-ark som brukes til utregning av de ønskede verdier.

3.6.4 Utregning av gjennomsnittet for ett sett med eksperimenter

Som nevnt tidligere, ble forsøk med samme fremgangsmetode gjennomført minst tre ganger for å minimalisere stokastiske variasjoner. For å finne gjennomsnitt-verdien for ett sett med forsøk, bruker vi vektet tilnærming for å finne gjennomsnittet. Denne tilnærmingen passer best siden antall flasker som ga gyldige resultater, for hver testdose, varierer. I enkelte

eksperimenter ble noen av testdosene ikke gjennomført på grunn av utilstrekkelig antall celler eller størrelsen på forsøket.

Vi bruker standardfeilen for hvert sett med flasker som vekttall. Da vil vi resultatet vektes med hensyn på både antall flasker i ett forsøk og variansen i forsøket.

Vi regner ut gjennomsnittet for M-korrigert overlevelsesfraksjon, f_m:

𝑓_𝑚 =

∑ 𝑓_𝑖 𝑆𝐸(𝑓_𝑖)²

𝑘𝑖=1

∑^𝑘_𝑖=1𝑆𝐸(𝑓_𝑖)²

𝑆𝐸(𝑓_𝑖) betegner standardfeilen for eksperiment «i», fi er M-korrigert overlevelsesfraksjon for forsøk «i». Vi har da gjennomført «k» eksperimenter med samme fremgangsmetode.

𝑓_𝑖

𝑆𝐸(𝑓_𝑖)² = 𝑛_𝑖𝑓_𝑖 𝜎²

Standardfeil for ett sett med eksperimenter regnes her med hensyn på gjennomsnittet for M- korrigert overlevelsesfraksjon, fm:

𝑆𝐸(𝑓_𝑚) = √ 1

𝑘(𝑘 − 1)(∑ 𝑓_𝑖 − 𝑓_𝑚

𝑘

𝑖=1

)

2