Caracterización de la fibrosis pulmonar en ratones nude para el desarrollo de un nuevo modelo de estudio de la fibrosis pulmonar idiopática

TRABAJO DE FIN DE GRADO

CARACTERIZACIÓN DE LA FIBROSIS PULMONAR EN RATONES NUDE PARA EL DESARROLLO DE UN NUEVO MODELO DE ESTUDIO DE LA FIBROSIS PULMONAR IDIOPÁTICA

Kristiyan Stiliyanov Atanasov

Grado de Bioquímica    Facultad de Ciencias

Año Académico 2020-21

CARACTERIZACIÓN DE LA FIBROSIS

PULMONAR EN RATONES NUDE PARA EL DESARROLLO DE UN NUEVO MODELO DE ESTUDIO DE LA FIBROSIS PULMONAR IDIOPÁTICA

Kristiyan Stiliyanov Atanasov

Trabajo de Fin de Grado Facultad de Ciencias      

Universidad de las Illes Balears

Año Académico 2020-21

Palabras clave del trabajo:

fibrosis pulmonar idiopática, nude, bleomicina, dosis repetidas.

Josep Mercader Barceló       

Se autoriza la Universidad a incluir este trabajo en el Repositorio Institucional para su consulta en acceso abierto y difusión en línea, con fines exclusivamente académicos y de investigación

Autor Tutor

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Resumen

La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es una patología caracterizada por la acumulación progresiva de matriz extracelular para la que no hay tratamiento curativo. Los ratones Swiss CD1-nude presentan inmunodeficiencia que los hace ideales para ensayos preclínicos para investigar el efecto de células humanas. El objetivo es caracterizar el modelo de FPI animal de ratones Swiss CD1-nude hembra de dosis repetidas de bleomicina (6 U/kg) simplificado (3 dosis) frente al modelo convencional de dosis única. Se realiza una valoración macroscópica de los lóbulos pulmonares, una cuantificación de cortes histológicos teñidos con hematoxilina-eosina, caracterización celular del lavado broncoalveolar (BAL) por citometría de flujo, análisis de la expresión génica por qPCR y Western blot. El modelo de dosis repetidas muestra una mayor proporción de leucocitos, y concretamente células mieloides en el BAL, los pulmones presentan más signos de fibrosis que la dosis única a nivel tisular. No hay variaciones significativas en la expresión del ARNm de genes involucrados en la biogénesis y función mitocondrial, la mitofagia, la inflamación o proteínas componentes de la matriz extracelular. Se concluye que los ratones Swiss CD1 presentan cierta resistencia a la bleomicina y que se deben analizar otros parámetros clave para valorar la FP para así valorar la necesidad de perfeccionar el modelo.

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a pathology characterized by the

progressive accumulation of extracellular matrix for which there is no curative

treatment. Swiss CD1-nude mice show immunodeficiency which makes them

ideal for preclinical tests to investigate the effect of human cells. The objective is

to characterize the animal IPF model of female Swiss CD1-nude mice with

repeated doses of bleomycin (6 U / kg). simplified (3 doses) versus the

conventional single dose model. A macroscopic evaluation of the pulmonary

lobes, a quantification of histological sections stained with hematoxylin-eosin,

cellular characterization of the bronchoalveolar lavage (BAL) by flow cytometry,

analysis of gene expression by qPCR and Western blot is performed. The

repeated dose model shows a higher proportion of leukocytes, and specifically

myeloid cells in the BAL, the lungs show more signs of fibrosis than the single

dose at the tissue level. There are no significant variations in the expression of

the mRNA of genes involved in mitochondrial biogenesis and function,

mitophagy, inflammation or component proteins of the extracellular matrix. It is

concluded that Swiss CD1 mice have some resistance to bleomycin and that

other key parameters should be analyzed to assess FP in order to assess the

need to refine the model.

Índice

● Resumen 2

● Introducción 4

● Hipótesis 7

● Objetivos 7

● Diseño experimental 7

● Resultados 9

○ 1.La administración de bleomicina a 6 U/kg no provoca la muerte en ratones

CD1-nude hembra, independientemente del número de dosis 9

○ 2.Los pesos corporales de los ratones no varían en función de la administración de bleomicina o el número de dosis de bleomicina administrada 9

○ 3.Los ratones nude presentan lesiones pulmonares de grado variable según el

número de dosis de bleomicina administradas 10

○ 4.Los ratones nude tratados con una y tres dosis de bleomicina muestran

características tisulares típicas de la fibrosis pulmonar 12

○ 5.Aumento de leucocitos en el BAL en respuesta a la administración de tres dosis de

bleomicina, pero no tras dosis única 13

○ 6.La expresión de αSMA no se ve afectada en respuesta a la bleomicina 14

○ 7.Los niveles de mRNA de proteínas de la MEC en pulmones de ratones nude

tratados con una o tres dosis de bleomicina no varían significativamente 14

○ 8.Los niveles de mRNA de genes relacionados con la función mitocondrial no

experimentan cambios con la administración de bleomicina 15

○ 9.Los niveles de PGAM5 disminuyen relativamente con la administración de

bleomicina 15

○ 10.Los niveles de mRNA de Il-6 en pulmón de ratones nude tienden a aumentar

con la administración de tres dosis de bleomicina 15

● Discusión 16

● Conclusión 17

○ Futuras direcciones 17

● Materiales y Métodos 18

○ Manipulación de animales inmunodeprimidos 18

○ Alojamiento y alimento 18

○ Administración de bleomicina/vehículo 18

○ Sedación 18

○ Sacrificio de los ratones 18

○ Fotografía de los pulmones 19

○ Recogida de muestras 19

○ Citometría de flujo 19

○ Tinción hematoxilina-eosina 19

○ Análisis semiautomático de fibrosis en cortes H-E 20

○ Extracción de RNA de pulmón 20

○ Cuantificación de RNA 20

○ Retrotranscripción 20

○ qPCR 21

○ Extracción de las proteínas 22

○ Cuantificación de las proteínas 23

○ Preparación de las muestras para SDS-PAGE 23

○ Preparación de los geles para SDS-PAGE 23

○ Electroforesis SDS-PAGE 24

○ Transferencia semi-seca a membrana 24

○ Western blotting 25

○ Tratamiento de datos y estadística 25

●

●

29

Introducción

La fibrosis pulmonar (FP) es una enfermedad pulmonar crónica caracterizada por la deposición de matriz extracelular en el espacio intersticial pulmonar, asociada a fenómenos de cicatrización recurrente. La fibrosis pulmonar es el grupo de enfermedades pulmonares fibróticas de etiología variable, clasificadas según la causa primaria del daño pulmonar. Existen formas de FP causadas por daño tisular resultado de una infección. Otra variante de FP es la asociada a enfermedad intersticial sistémica, llamada neumopatía intersticial, se da en pacientes con esclerosis sistémica (ES). Algunas formas de FP se relacionan con el tabaquismo prolongado, la exposición a partículas como el sílice cristalino o el carbón (neumoconiosis), y/o lesiones mecánicas asociadas a aspiración forzada o ventilación artificial . Además de estas condiciones, existen enfermedades raras, como la histiocitosis de Erdheim-Chester o el síndrome de Hermansky-Pudlak, que pueden dar lugar a fibrosis pulmonar (1) . Una forma de creciente prevalencia es la fibrosis pulmonar idiopática (FPI), cuyo rasgo característico es la ausencia de una etiología subyacente, de ahí su denominación como “idiopática”.

La FPI es una variante de fibrosis pulmonar de naturaleza crónica y progresiva, cuyo pronóstico es actualmente fatal. Se trata de una patología que se caracteriza por la deposición de matriz extracelular (MEC) en los pulmones siguiendo un patrón de panal de abejas o honeycombing, que se refleja en forma de una neumonía intersticial común (NIC) (2) . Esta enfermedad posee una prevalencia de aproximadamente 14 a 30 casos por 100.000 habitantes (3) , siendo más común en varones y, especialmente, en aquellos mayores de 65 años (4) . La incidencia de FPI, de 2,8 a 9,3 por 100.000 habitantes, se encuentra en una tendencia al alza (4). Las pautas de diagnóstico de la FPI son la identificación de un patrón de NIC en imágenes de tomografía computerizada de alta resolución (HRCT) y el estudio de biopsias pulmonares (5) . Actualmente no existe cura y la esperanza de vida después del diagnóstico es de entre 2 a 3 años, aumentando hasta de 3 a 5 años si se aplica un tratamiento (3) . La FPI es una patología estrechamente ligada a la edad y existe un alto grado de comorbilidad entre los pacientes con FPI que también sufren otras patologías con mayor incidencia en edades avanzadas y que afectan a los pulmones, este es el caso de la hipertensión pulmonar (3-86% de coincidencia) o la apnea del sueño obstructiva (6-91% de coincidencia) (6,7) .

A nivel histológico, los pulmones de pacientes con FPI muestran una estructura característica de neumonía intersticial común, con una extensiva acumulación de MEC compuesta principalmente por fibrillas de colágeno de tipo 1a y fibronectina, además de focos o “foci” de fibroblastos en proliferación (8) . A nivel tisular, las regiones o parches fibróticos se suelen localizar en las zonas subpleural y paraseptal (periférica), distribuidas en torno al lóbulo pulmonar inferior, pudiendo extenderse hasta el lóbulo superior en fases avanzadas, siguiendo un patrón altamente heterogéneo, que visualizado mediante tomografía recuerda al panal de abejas o honeycombing. Estas características histopatológicas permiten distinguir entre la neumonía intersticial común y otros patrones fibróticos como la neumonía intersticial fibrótica inespecífica y la fibrosis intersticial centrada en las vías aéreas (1) .

Figura 1.Imagen por tomografía computerizada de los pulmones de un paciente sano (a la izquierda) y de un paciente con FPI (a la derecha), donde se puede observar la estructura característica de panal de abejas en las zonas periféricas de los lóbulos pulmonares. Imágenes por Dr. Andrew Dixon y Dr Bruno Di Muzio and Dr Yuranga Weerakkody et al. Correspondientemente (radiopaedia.org).

Las factores implicados en la patogénesis de la FPI son variables y no excluyentes entre sí. Existe una variante familiar de FPI ligada a la genética y de sintomatología que varía entre los diferentes grupos familiares (9) . Varios loci asociados a la FPI han sido identificados, destacando algunas variantes genéticas tipo SNP (single nucleotide polymorphism) en los genes para la proteína surfactante de las células epiteliales pulmonares del tipo II (SFTPC y SFTPA) (10) , una variante de alelo común del gen MUC5B (11) o mutaciones en el gen de la telomerasa (TERT) (12) . Se ha establecido una relación entre la incidencia de FPI y hábitos como el tabaquismo (13) , y la relación entre el consumo de alcohol y la fibrosis experimental por bleomicina (13) . Se ha postulado que existe una relación entre la dieta y el desarrollo de FPI, noción que se respalda por varios estudios que prueban el efecto de diversos componentes bioactivos sobre la aparición, avance y resolución de la fibrosis pulmonar experimental (14) . La microbiota intestinal y, recientemente, la microbiota pulmonar se han establecido como factores etiológicos potenciales en el desarrollo de FPI (15) .

La patogénesis de la FPI destaca por el papel central de los mecanismos remodeladores asociados a daño tisular, responsables de iniciar y mantener el fenómeno de cicatrización aberrante característico de la FPI. La vía principal de remodelación-cicatrización es la vía del TGF-beta (transforming growth factor-beta), una citoquina que, mediante la activación de proteinas en la señalización downstream de la vía con actividad de factor transcripcional, estimula la síntesis y secreción de MEC, la proliferación de fibroblastos y su diferenciación a un fenotipo contráctil, los miofibroblastos (16) . Esta vía central se acompaña de la secreción de varias citoquinas proinflamatorias, como IL-1b (interleuquina 1 beta) e IL-6 (interleuquina 6), que promueven la activación de factores de transcripción como NF-kb (nuclear factor kappa-beta). Se ha observado que las células mesenquimales estromales de pulmón, los fibroblastos, de pacientes de FPI muestran disfunción mitocondrial (17–19) . A menudo vías de señalización implicadas en el desarrollo como Wnt/beta-CAT, se encuentran activadas en la mayoría de casos de FPI (20) . Varios RNAs no codificantes se han asociado a la fibrosis pulmonar, como algunos miRNA que actúan modulando la transcripción de factores relevantes en el proceso de la fibrosis (21) .

Figura 2. Vía de señalización por TFG-beta.

Kang H. Role of MicroRNAs in TGF-β Signaling Pathway-Mediated Pulmonary Fibrosis.

International Journal of Molecular Sciences.

2017; 18(12):2527.

https://doi.org/10.3390/ijms18122527.

Actualmente están aprobados dos fármacos para el tratamiento de la FPI, la pirfenidona y el nintedanib (22) . La pirfenidona es un agente antifibrótico que actúa inhibiendo la activación/diferenciación de los miofibroblastos, responsables de la deposición de MEC. El efecto de la pirferidona es mediado por un aumento de la mitofagia, regulando la activación por parte de PARK2 del receptor de PDGF (platelet derived growth factor), PDGFR (23) . El nintedanib, un inhibidor de las tirosina quinasas con múltiples dianas, actúa inhibiendo la fosforilación del receptor de TGF-beta del tipo II, la activación de SMAD3 y la activación de la proteína quinasa activada por mitógenos p38, resultando en una disminución de la producción de MEC a nivel transcripcional (genes de la fibronectina y el colágeno 1a1) (24) . Ambos fármacos muestran efectos antifibróticos, que resultan en una reducción del avance de la fibrosis en fases tempranas, fases de avance medio y en estadíos avanzados de la FPI (24) . Actualmente se están estudiando multitud de nuevas estrategias terapéuticas que pretenden actuar sobre alguno de los muchos mecanismos que intervienen en la patogénesis y avance de la FPI. Los fármacos senolíticos, que actúan sobre las células senescientes induciendo su apoptosis, son una nueva variante de fármacos que se estudia para el tratamiento de la fibrosis pulmonar idiopática por la alta presencia de células en senescencia en los pulmones de pacientes con FPI (25) . El desarrollo de anticuerpos anti-colágeno, que se unen a esta proteína y estimulan su degradación, supone un avance en la utilización de la inmunoterapia para el tratamiento

de enfermedades fibróticas, como es el caso de la FPI (26) .

La terapia celular es un potencial tratamiento que consiste en la aplicación de células purificadas con la capacidad de regenerar un tejido o de mejorar una afección. Existen dos variantes de terapia celular según el origen de las células, la terapia celular autóloga, que usa las células del propio receptor, y la terapia celular alogénica, que usa células de un donante que son transplantadas en un receptor. Se han realizado muchos estudios en modelos animales en los que se pueden observar efectos regenerativos o de mejora en la condición de fibrosis pulmonar experimental inducida por bleomicina (27) o sílice cristalino(28) tras el tratamiento con varios tipos de células. Las células madre mesenquimales del tejido adiposo (AT-MSCs) son un candidato interesante de células para el transplante, demostrando un efecto beneficioso sobre la FP (28) . Las células madre mesenquimales de cordón umbilical (UC-MSCs) también han mostrado efectos prometedores en el tratamiento de la fibrosis experimental (29) . A día de hoy, se han realizado o se están realizando un total de 8 ensayos clínicos para investigar el beneficio de MSC en la FPI. La mayoría de ensayos clínicos no han demostrado efectos beneficiosos significativos, sin demostrar tampoco efectos adversos asociados a la terapia celular. Un ensayo clínico de terapia celular con células madre mesenquimales de médula ósea, utilizando concentraciones de células muy altas, ha demostrado efectos beneficiosos disminuyendo los síntomas en pacientes con FPI leve a moderada (30) . Estos últimos resultados suponen un avance muy importante, que sumado a resultados de ensayos preclínicos apoyan la necesidad de aumentar nuestros conocimientos sobre la terapia celular, como un tratamiento prometedor para la FPI.

La FPI requiere del uso de modelos experimentales para el desarrollo de nuevos tratamientos o el estudio de los mecanismos moleculares implicados en el desarrollo de la patología. El modelo animal más estudiado es el ratón tratado con bleomicina (un agente que induce daño en el DNA utilizado como quimioterapia para el tratamiento de algunos tipos de cáncer) por vía intratraqueal, aunque hay animales que desarrollan formas de fibrosis pulmonar de manera espontánea, como son perros, caballos o burros, haciendo el estudio de estos especialmente interesante por la mayor semejanza con la FPI (31) . Los perros de la raza West Highland White Terrier poseen una especial tendencia a desarrollar una forma de fibrosis pulmonar, sugiriendo una predisposición genética a esta enfermedad (32) . La fibrosis experimental inducida por bleomicina (BLM) posee una naturaleza inflamatoria importante y suele resolverse de manera espontánea en ratones jóvenes si no se aplica en dosis repetidas (33) . La aplicación de dosis repetidas de bleomicina emula las lesiones repetidas y conduce a la remodelación y cicatrización prolongada y extensiva en los pulmones de los ratones, asemejándose en mayor medida a la FPI en humanos (48) .

Los ratones del fenotipo nude son ratones que se caracterizan por un aspecto falto de pelaje o

“desnudo” y la ausencia de timo (atímicos). Estos ratones poseen una mutación de pérdida de la función en ambos alelos del gen Foxn1 (Foxn1 ^nu/nu) dando lugar a esta disgénesis del timo, que se traduce en una falta casi completa de células T funcionales (34) . Dada su condición inmunitaria los ratones nude suponen un candidato idóneo para el estudio de terapias celulares con células humanas, como las UC-MSCs,teniendo presente que como las UC-MSCs. la administración de MSCs humanas genera inflamación en ratones salvajes e inmunocompetentes, lo que dificulta en gran medida el análisis de su potencial efecto beneficioso sobre la fibrosis.

Hipótesis

Los ratones nude presentan un sistema inmuneparticular, caracterizado por la falta de timo. Por eso cabe esperar que existan diferencias en la respuesta a la bleomicina a nivel tisular, citológico y molecular entre ratones inmunocompetentes y ratones nude, que es necesario caracterizar antes de poder analizar los efectos de la terapia celular. Se plantea un modelo de dosis repetidas simplificado (3 dosis totales) recientemente descrito por Redente et. al. en ratones (35), frente al modelo de dosis repetidas completo (16 dosis) (36) y el modelo de dosis única más estandarizado, utilizando como animal de experimentación los ratones Swiss CD-1 nude. Así, la hipótesis del presente trabajo es que la administración de dosis repetidas de bleomicina en ratones nude inducirá características de fibrosis pulmonar que serán distintas a las desencadenadas por la dosis única y se asemejarán más a los desarrolladas en la FPI.

Objetivos

El objetivo generales caracterizar la FP inducida por tres dosis de bleomicina en ratones Swiss CD1 nude a nivel histológico, celular y molecular, de forma comparativa con la desencadenada por la dosis única. Esta caracterización servirá de base para el desarrollo de un modelo semejante a la FPI y útil para el estudio de terapias celulares con células humanas.

Los objetivosespecíficosprincipales son:

I. Valorar la FP en los lóbulos pulmonares perfundidos y en cortes teñidos con hematoxilina eosina.

II. Analizar las poblaciones celulares del lavado broncoalveolar mediante citometría de flujo.

III. Analizar la expresión de marcadores fibróticos por Western blot y qPCR IV. Analizar la expresión de genes inflamatorios por qPCR

V. Analizar la expresión de genes relacionados con la función mitocondrial por Western blot y qPCR Diseño experimental

El objetivo de este trabajo es inducir la fibrosis pulmonar en un modelo de roedor para evaluar, en un futuro, el beneficio de la terapia con células humanas. Experimentos preliminares muestran que la administración de MSC humanas en ratones inmunocompetentes induce una reacción inflamatoria que alteraría el análisis del posible efecto terapéutico. Por este motivo se eligen ratones nude en los que dicha reacción no se produce. Sin embargo, este genotipo presenta una respuesta a la bleomicina atenuada en comparación a la que se desencadena en los ratones heterocigotos, de acuerdo con los resultados recientes obtenidos por el grupo I-Respire. Por tanto, en este trabajo pretendemos caracterizar la fibrosis pulmonar siguiendo un protocolo recientemente descrito en otra cepa de ratones que consiste en la administración bisemanal de tres dosis de bleomicina (35). El modelo simplificado de dosis repetidas recapitula los eventos patológicos de una forma más parecida a los que ocurren en la FPI humana, que el protocolo estándar de dosis única.

Los ratones se dividen en grupos considerando la potencial mortalidad asociada a la administración de 3 dosis de bleomicina, buscando un equilibrio entre un valor de n adecuado para el experimento y el uso mínimo de animales. El número de animales por grupo es el siguiente: para el grupo control (Vehículo o PBS), n=4; para el grupo de 1 dosis, n=4; y para el grupo de 3 dosis, n=6. Las dosis de bleomicina o vehículo son administradas con 14 días de diferencia entre sí, de acuerdo con el protocolo simplificado de dosis repetidas establecido por Redente EF (35). El grupo control recibe 3 instilaciones de 50 µl (por 30 g de peso corporal) de PBS 1X estéril, separadas temporalmente por 14 días. El grupo de 1 dosis recibe 1 única instilación de bleomicina, coincidiendo con la última dosis que recibe el grupo tres dosis. Los ratones reciben 1 o 3 dosis de bleomicina intratraqueal a 6 U/kg de peso corporal. La dosis de bleomicina se estableció de acuerdo a resultados previos obtenidos por el grupo de investigación I-Respire, que determinaban que la dosis más comúnmente utilizada en modelos experimentales, 2 U/kg, induce una fibrosis pulmonar leve en los ratones Swiss CD1 nude, a diferencia de lo que ocurre en ratones de otras cepas. Por otra parte, el incremento en la dosis hasta 12U/kg no suponía un aumento en los marcadores de fibrosis en comparación con la dosis de 6 U/kg.

Previo al análisis histológico se observa si los pulmones de los ratones presentan lesiones u otros signos de fibrosis a nivel macroscópico.La fibrosis pulmonar posee un perfil histológico característico que permite su identificación y la estimación del grado de fibrosis. Por eso se analizan cortes histológicos teñidos por hematoxilina-eosina en busca de características de la fibrosis como focos de fibroblastos en proliferación, abundancia de MEC y/o un patrón heterogéneo de deposición de esta

matriz, en contraste con el tejido pulmonar sano. Por medio de análisis de imagen con software se calcula el área libre (de tejido, células y/o MEC), que en principio tendrá que ser mayor en pulmones sanos que en pulmones fibróticos. También se analiza el lavado broncoalveolar (BAL) por citometría de flujo simple, cuantificando las poblaciones de células inmunes infiltradas, pudiendo estimarse la proporción de los diferentes leucocitos. Esta información nos permite analizar aspectos inmunológicos de la fibrosis pulmonar desarrollada en este modelo de tres dosis bisemanales de bleomicina, comparando con la respuesta a bleomicina en el modelo de dosis única. La fibrosis pulmonar destaca por una sobreproducción de colágeno y fibronectina (componentes de la MEC), hecho por el que se estudian los niveles de mRNA de Col1a1 y Fn. Además, se analizan los niveles de mRNA y proteína aSMA, una proteína clave en la identificación de miofibroblastos, cuya expresión se ve incrementada durante la activación de los miofibroblastos, tanto en los síntomas primarios de la FPI (37), como en el modelo estándar de bleomicina (38,39). Por otro lado, también se analiza la concentración de mRNA de periostina, una proteína que se ha descrito recientemente que posee un papel en la remodelación tisular y la dinámica de la MEC en la FPI (40,41). Las citoquinas proinflamatorias interleuquina 6, interleuquina 1-beta y la proteína quimiotáctica de monocitos 1 se analizan a nivel de mRNA para cuantificar la respuesta inflamatoria frente a la bleomicina. También se analiza la expresión (en forma de mRNA) de proteínas relevantes en la función y biogénesis mitocondrial (CoxII, Pgc1a y Pink1), porque el grupo I-Respire ha descrito que la función mitocondrial está comprometida en células de los pulmones de pacientes con FPI (19), por lo que resulta de interés analizar la función mitocondrial en modelos experimentales. También se estudia la concentración relativa de la proteína PGAM5, como proteína relevante en la mitofagia, cuyo papel en la patogénesis de la FPI se ha descrito recientemente (42).

Resultados

1. La administración de bleomicina a 6 U/kg no provoca la muerte en ratones CD1-nude hembra, independientemente del número de dosis

Ningún ratón de los tres grupos experimentales murió durante el experimento previamente del sacrificio cuando se espera una mortalidad del 10-20% según la cepa tras la administración de una dosis de 2 a 6 U/kg..

2. Los pesos corporales de los ratones no varían en función de la administración de bleomicina o el número de dosis de bleomicina administrada

Figura 3. Evolución del peso corporal de los ratones de los tres grupos experimentales con las medias y el error estándar de la media (SEM). Grupo control representado con puntos en color negro; grupo de una dosis representado por cuadrados en color azul; grupo de tres dosis representado por triángulos en color rojo. Las flechas negras indican la administración de bleomicina 6 U/kg / vehículo.

Los pesos corporales de los ratones control y de los grupos tratados con 1 y 3 dosis de bleomicina no variaron significativamente a lo largo del procedimiento (p-valor para control=0,5007, p-valor para 3 dosis=0,2028, p-valor para 1 dosis=0,6273 realizando un ANOVA de valores repetidos de una vía) indicando que la administración de bleomicina en dosis única o repetida bisemanalmente no afecta el peso de los animales.

3. Los ratones nude presentan lesiones pulmonares de grado variable según el número de dosis de bleomicina administradas

Figura 4. Fotografías de los pulmones de individuos representativos de los grupos experimentales, indicados en la parte superior de la correspondiente foto. Las zonas más oscuras se indican con flechas verdes.

Los pulmones a simple vista revelan diferencias morfológicas entre los tres grupos experimentales.

Los pulmones del grupo control, después de la perfusión con PBS, se pueden observar como varios

lóbulos pulmonares de textura esponjosa (por las ramificaciones alveolares) y coloración blanquecina, sin áreas rosadas u oscuras. Los pulmones de los ratones tratados con una dosis de bleomicina ya presentan áreas de un tono más oscuro y coloración rosada (indicados con flecha verde), que recuerdan a lesiones fibróticas. En los ratones tratados con tres dosis de bleomicina se pueden observar áreas de un tono más oscuro con aspecto de manchas (indicadas con flechas verdes) y una distribución que recuerda al patrón característico de panal de abeja o honeycombing en pacientes con FPI.

4. Los ratones nude tratados con una y tres dosis de bleomicina muestran características tisulares típicas de la fibrosis pulmonar

Figura 5. Micrografías (aumento 5X) a color de cortes histológicos de pulmón teñidos con hetoxilina-eosina. Las flechas verdes indican acumulaciones de células del parénquima pulmonar o focos fibroblásticos. Los triángulos naranjas indican conductos alveolares, con una concentración de células pulmonares epiteliales. a. control, tratado con PBS. b. tratado con 1 dosis de bleomicina. c. tratado con 3 dosis de bleomicina.

Observando las imágenes microscópicas se pueden discernir las diferencias en densidad celular que existen entre los tres grupos experimentales. En el grupo control apenas se perciben focos de células.

Por otro lado, en los pulmones de ratones tratados con bleomicina (tanto una dosis como tres dosis) se pueden observar puntos en la imagen en que se concentran un mayor número de células (flechas verdes). Además, a nivel general, el parénquima de los pulmones de ratones tratados con bleomicina, tanto una como tres dosis, posee una intensidad en la tinción mayor.

Figura 6. Cuantificación del área libre en micrografías de cortes histológicos de pulmón (aumento 20X) por ImageJ. a. Diagrama de barras representando la media y el SEM del porcentaje de área libre en los 3 grupos experimentales. b. Diagrama de puntos representando el valor de área libre en cada foto, en función de la muestra. Todas las muestras (a excepción de #1, n=8, y #13, n=9) n=10). c. Representación gráfica del porcentaje de campos definidos por fotografías con un valor de área libre <60%. d. Frecuencia relativa de los valores de porcentaje de área libre.

Los pulmones de ratones nude control muestran el mayor porcentaje promedio de área libre (72,9±2,2% de media). Los ratones tratados con una dosis de bleomicina mostraron un porcentaje de área libre (64,6±6,8% de media;) aparentemente disminuido (p-valor=0,2891, en prueba T de Student) respecto a los ratones control, Siguiendo la misma tendencia, los ratones tratados con tres dosis de bleomicina mostraron un porcentaje de área libre (63,4±4% de media;) disminuido respecto a los ratones control (p-valor=0,1146, en prueba T de Student). La administración de tres dosis de bleomicina en comparación al modelo convencional de dosis única no demuestra una reducción considerable del área libre del parénquima pulmonar (p-valor=0,8735, en prueba T de Student).

Grupo Control (PBS) 1 dosis BLM (6 U/kg) 3 dosis BLM (6 U/kg)

Individuo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Promedio

área libre (%) 74,23 78,15 71,72 67,63 46,7 63,09 69,76 78,92 73,34 51,15 72,68 68,5 63,02 51,73 Desviación

estándar (SD) 4,484 1,431 4,274 3,289 23,64 8,892 3,058 4,289 2,825 13,99 2,417 4,362 3,731 20,04 Error

estándar de la media (SEM)

1,585 0,452

5 1,351 1,04 7,474 2,812 0,967

1 1,356 0,893

3 4,425 0,764

5 1,379 1,244 6,337 Coeficiente

de variación 6,04

%

1,83

%

5,96

%

4,86

%

50,61

%

14,09

%

4,38

%

5,43

%

3,85

%

27,36

%

3,33

%

6,37

%

5,92

%

38,74

% Tabla 1. Resultados de cuantificación de área libre por muestra. El número de campos analizado es n=10, a excepción de #1, n=8, y #13, n=9.

Por otro lado, si observamos la heterogeneidad de los valores de área libre entre los distintos campos analizados de un mismo corte (Figura 6, b) se puede apreciar una afectación no homogénea en un mismo individuo en los ratones del grupo de una dosis y en los individuos del grupo de tres dosis de bleomicina, en varios de los cuales variando hasta más del 25% (#5, #10 y #14) (SD, SEM y Coeficiente de variación, Tabla 1). Resulta de interés, por el patrón de lesiones heterogéneo característico de la fibrosis pulmonar, el estudio del número o frecuencia de campos que presentan un valor de área libre inferior al 60% (valor umbral definido arbitrariamente para discernir las regiones afectadas de las sanas). Analizando este parámetro encontramos una diferencia entre el grupo control y el grupo una dosis (p=0,2070 para prueba T de Student), siendo algo mayor la diferencia encontrada entre el grupo control y el grupo tres dosis (p=0,1674 para prueba T de Student). Entre una dosis y tres dosis la diferencia es muy pequeña (p=0,8651 para prueba T de Student).

Observando las frecuencias relativas de porcentaje de área libre para los tres grupos experimentales podemos apreciar una mayor frecuencia de valores más reducidos en ratones tratados con una dosis de bleomicina y ratones tratados con tres dosis, siendo estos últimos donde existe una frecuencia mayor (Figura 6, d). Como contraste frente a la cuantificación de área libre sería interesante valorar el grado de fibrosis por la escala Ashcroft.

5. Aumento de leucocitos en el BAL en respuesta a la administración de tres dosis de bleomicina, pero no tras dosis única

Figura 7. Citometría de flujo de lavado broncoalveolar (BAL). Gates definidos, representativos de las 3 poblaciones de leucocitos; P1=linfocitos, P2=macrófagos, P3=granulocitos. b. Porcentaje de linfocitos (eventos P1) respecto a los eventos totales. c. Porcentaje de macrófagos (eventos P2) respecto a los eventos totales. d.

Porcentaje de granulocitos (eventos P3) respecto a los eventos totales. e. Porcentaje de células de origen mieloide (P2+P3) respecto a los eventos totales. f. Porcentaje de leucocitos (P1+P2+P3) respecto a los eventos totales. g-j. Porcentaje de los eventos indicados respecto al número de eventos P1+P2+P3 totales, distribución de los leucocitos. *: p<0,05; **: p<0,01 para prueba T de Student.

Los resultados de la citometría de flujo revelan una tendencia a un incremento de las tres poblaciones de leucocitos en el BAL definidas por las gates, en respuesta a la bleomicina En linfocitos (P1) se observa un ligero aumento progresivo con el aumento de número de dosis administradas, sin haber diferencias importantes entre el grupo control y el grupo una dosis (p=0,4466). Entre el grupo control y el grupo de tres dosis se produce un aumento mucho más evidente del porcentaje de linfocitos en BAL (p=0,0598), sugiriendo un efecto estimulador de la respuesta inmune mayor en administraciones repetidas de bleomicina. Entre el grupo de una dosis y el grupo de tres dosis también se observa cierta diferencia, aunque no es significativa (p=0,4004).

Los macrófagos, células mucho más voluminosas que los linfocitos, no siguen el mismo patrón de respuesta totalmente. El grupo de una dosis no muestra un claro aumento respecto al grupo control (p=0,4170), pero sí se puede notar un incremento importante de los macrófagos en BAL entre los controles y el grupo de tres dosis de bleomicina (p=0,0816). No existe una diferencia tan pronunciada entre el grupo de dosis única y el grupo de tres dosis (p=0,1958), pero sí resulta mayor a la que existe entre grupo control y grupo una dosis, indicativo de un efecto diferencial de las tres dosis de bleomicina. Los granulocitos son células de origen mieloide y funciones diversas, reciben su nombre por la estructura de su núcleo (PMNs o polimorfonucleares) o las formaciones granulares de la superficie, lo que les dota de una mayor complejidad frente a la dispersión lateral (SSC). La respuesta de los granulocitos recuerda en gran medida a los macrófagos, habiendo más granulocitos en ratones tratados tres veces con bleomicina, frente a aquellos del grupo control (p=0,1301) o los administrados con una única dosis de bleomicina (p=0,1153). No existe apenas diferencia entre los ratones control y los ratones una dosis (p=0,9283). Si consideramos conjuntamente las células de origen mieloide (macrófagos y granulocitos), representantes de la respuesta inmune innata, se observan claros cambios entre el grupo control y el grupo de tres dosis, produciéndose un aumento en éste último (p=0,0174), así ocurre también entre los ratones tratados con una dosis y los tratados con tres dosis (p=0,0202). Por otro lado, entre el grupo control y el grupo una dosis no se aprecian cambios (p=0,7285). Si consideramos las tres poblaciones conjuntamente (leucocitos), los ratones tratados con tres dosis de bleomicina muestran un aumento generalizado de los leucocitos en BAL, en comparación tanto con el grupo control (p=0,0034) como con el grupo una dosis (p=0,0156), fenómeno que no ocurre con la administración de una única dosis de bleomicina.

Si analizamos la proporción de cada tipo de leucocito respecto al total de leucocitos no observamos ninguna diferencia entre grupos experimentales (p>0,05) (Figura 3. g-j). (p-valores en prueba T de Student).

6. La expresión de αSMA no se ve afectada en respuesta a la bleomicina

Figura 8.Expresión génica de alpha smooth muscle actin a nivel de mRNA y proteína (indicado).

La transcripción del mRNA para αSMA en pulmón, codificada por el gen Acta2 en ratones, no se ve aumentada ni disminuida en función de la administración o el número de administraciones de bleomicina (ningún p<0,05 para las pruebas T de Student entre los tres grupos). Por otro lado, sí se observa un ligero aumento de la proteína αSMA en los pulmones de ratones nude tratados con bleomicina respecto a ratones control, aunque no es significativo debido a la alta variabilidad entre los ratones tratados con bleomicina (p=0,4133 para control vs. 1 dosis; p=0,5183 para control vs. 3 dosis), independientemente del número de dosis (p=0,9725), obteniéndose valores equiparables.

7. Los niveles de mRNA de proteínas de la MEC en pulmones de ratones nude tratados con una o tres dosis de bleomicina no varían significativamente

Figura 9. Niveles relativos de mRNA que codifican para proteínas de la MEC. Col1a1: Colágeno 1 a1; Fn:

Fibronectina; Postn: Periostina.

Los niveles de mRNA de Col1a1, que codifica para la fibra de colágeno tipo 1 alfa 1, no presentan diferencias significativas entre los grupos experimentales pero se puede apreciar una leve tendencia al alza entre el grupo control y el grupo de una dosis (p=0,3745), coincidiendo esta tendencia con la que se observa entre el grupo control y el grupo de tres dosis (p=0,3945). Entre los grupos de una dosis y tres dosis no se aprecian diferencias (p=9058). La fibronectina, otra componente de la MEC que se produce en exceso en la FPI, presenta una expresión aumentada en el grupo tratado con una dosis de bleomicina respecto al grupo control, aunque no es significativa (p=0,2009). En cambio, en ratones tratados con tres dosis de bleomicina no se observa esta tendencia (p=0,3819). Entre los grupos tratados con bleomicina (1 dosis BLM y 3 dosis BLM) no hay una diferencia significativa (p=0,6214). La periostina, un componente de la MEC, identificada recientemente como proteína relevante en la fibrosis pulmonar (41), tiende a disminuir con la administración de bleomicina (p=0,3572 PBS vs. 1 dosis BLM; y p=0,3949 PBS vs. 3 dosis BLM), y no se observan diferencias entre el grupo de una dosis y el grupo de tres dosis (p=0,8839). (p-valores en prueba T de Student).

8. Los niveles de mRNA de genes relacionados con la función mitocondrial no experimentan cambios con la administración de bleomicina

Figura 10. Concentración relativa de mRNA de proteínas con papel mitocondrial. CoxII: citocromo oxidasa subunidad II; PGC1a: PPAR gamma coactivator 1; PINK1: PTEN-induced kinase 1.

Los genes con un papel en la homeostasis y función mitocondrial son de interés por el reciente descubrimiento de la implicación de la disfunción mitocondrial en células mesenquimales pulmonares en pacientes con FPI ¹⁹. Los niveles de mRNA de CoxII, la subunidad II de la citocromo c oxidasa, un componente de la cadena respiratoria, no sufren cambios significativos en respuesta a la bleomicina.

Los niveles de mRNA de PGC1a (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha), proteína con papel en la biogénesis mitocondrial, y PINK1 (PTEN-induced kinase 1), con un papel en la mitofagia, no sufren cambios con la administración de bleomicina.

9. Los niveles de PGAM5 disminuyen relativamente con la administración de bleomicina Figura 11. Concentración relativa de PGAM5 en pulmón de ratón, Western blot.

Los nivelesde PGAM5, una proteína involucrada en la mitofagia que recientemente se ha vinculado a la FP (42), tienden a disminuir en el grupo de una dosis respecto el grupo control (p=0,5719), siendo este descenso mucho más pronunciado en el grupo tratado con tres dosis de bleomicina (p=0,2723), aunque estos cambios no son estadísticamente significativos en ninguno de los dos grupos. Entre el grupo de una dosis y el grupo de tres dosis no existen diferencias tan marcadas (p=0,6097). (p-valores en prueba T de Student).

10. Los niveles de mRNA de Il-6 en pulmón de ratones nude tienden a aumentar con la administración de tres dosis de bleomicina

Figura 12.Niveles de mRNA relativos de genes asociados a la inflamación. Interleuquina 6, interleuquina 1-beta y proteína quimiotáctica de monocitos 1.

La expresión a nivel de mRNA de la interleuquina 6, una citoquina proinflamatoria, se ve aumentado considerablemente en los pulmones de ratones tratados con tres dosis de bleomicina respecto a los ratones control, algo más del triple de promedio respecto al control (0,7350 del grupo control frente a 3,232 del grupo tres dosis), pero no es estadísticamente significativa debido a una gran variabilidad interindividual (p=0,2021). Por otro lado, el grupo de una dosis no presenta este aumento respecto el control (p=0,7692 para prueba T de Student). Esto comporta un aumento algo menor entre el grupo de tres dosis respecto al grupo de una dosis (p=0,2559) (0,9390 del grupo de una dosis frente a 3,232 del grupo de tres dosis). La interleuquina 1-beta y MCP1 son, igual que la interleuquina 6, citoquinas proinflamatorias. La expresión de estas citoquinas no sufre cambios notables entre grupos experimentales (p-valor>0,05). (p-valores en prueba T de Student).

Discusión

Los pulmones de ratones CD1-nude hembra tratados con tres dosis de bleomicina a 6 U/kg muestran a nivel macroscópico signos de fibrosis en la forma de lesiones con coloración más oscura a lo largo del tejido pulmonar. Esto no es tan visible en los pulmones de ratones tratados con una dosis única de bleomicina. Esto nos sugiere que existe remodelación en un grado dependiente del número de dosis de bleomicina. Los resultados de la cuantificación del área libre nos plantean que el modelo de tres dosis y el modelo de dosis única no presentan valores tan diferentes pero se puede apreciar una mayor frecuencia de campos con área libre<60% en los ratones del grupo de tres dosis. También se puede observar la heterogeneidad de la fibrosis según el sector del pulmón analizado, una característica común con la FPI humana. Los ratones nude hembra pertenecientes al grupo de tres dosis presentaron una proporción de leucocitos en el BAL significativamente más elevada que sus contrapartes control o una dosis. Analizando las poblaciones leucocitarias por separado se puede apreciar un aumento significativo en las células mieloides (macrófagos y granulocitos). Este hecho nos sugiere que la administración de tres dosis reiteradas de bleomicina 6 U/kg, en ratones CD1-nude hembra produce un aumento en los macrófagos y granulocitos, mediante la estimulación del sistema inmunitario. Por otro lado, cabe mencionar que el pico de inflamación asociada a la administración de bleomicina se produce al día 4, transcurriendo 10 días entre este y la siguiente dosis o el sacrificio. A día 14 se produce una mayor remodelación tisular (fibrosis), según experimentos anteriores del grupo I-Respire. La falta, prácticamente total, de células T maduras también implica una dinámica inmunológica considerablemente diferente a los ratones salvajes o ratones comunes. Este hecho condiciona en un grado variable la respuesta al daño por bleomicina, provocando un daño y una fibrosis considerablemente menores que en ratones comunes. Al tener en cuenta los resultados de experimentos anteriores y los resultados obtenidos con este experimento de la expresión de mRNA de colágeno 1a 1, fibronectina y aSMA, se puede llegar a la sospecha de que las células T, ausentes en ratones nude, tienen un papel esencial en el desarrollo de la fibrosis pulmonar por bleomicina.

Dotando a los ratones de este fenotipo de una resistencia al daño causado por este compuesto. Si consideramos la resistencia a la bleomicina de los ratones de la cepa Swiss-CD1 observada en experimentos anteriores nos encontramos con ratones que muestran una resistencia considerable a la aparición de fibrosis en comparación con otras cepas. Además, puede haber diferencias en la respuesta a bleomicina dependientes del sexo. Así, comparado estos resultados con experimentos previos parece ser que las hembras de esta cepa son más resistentes que los machos, observación que se está investigando actualmente.

Analizando los resultados de expresión génica a nivel de mRNA y proteína se puede plantear la opción de que en el caso de hembras CD1-nude los mecanismos mediante los cuáles se produce la fibrosis son diferentes, teniendo un papel principal o importante proteínas que no hemos investigado.

Por otro lado, también existe la posibilidad de que los mecanismos de activación de los genes se produce a un nivel no estudiado ( colágeno a nivel de proteína, por ejemplo) y necesario para caracterizar la fibrosis pulmonar debidamente. Cabe destacar que la expresión de los genes asociados a la función mitocondrial, biogénesis y mitofagia están no presentan cambios, resultados que refuerzan la idea de que los ratones Swiss CD-1 nude hembra presentan cierta resistencia a los efectos profibróticos de la bleomicina.

Conclusión

1. El modelo simplificado de dosis repetidas de bleomicina en ratones Swiss CD1-nude hembra muestra algunas características histológicas similares a la de pacientes con FPI, aunque parece que estos ratones presentan cierta resistencia a la bleomicina.

2. La administración de tres dosis de bleomicina, pero no de una única dosis, induce un aumento de los leucocitos a nivel de pulmón.

3. Este modelo no presenta cambios en la expresión a nivel de mRNA de genes que codifican para proteínas de la MEC y citoquinas proinflamatorias.

4. La disfunción mitocondrial parece no desencadenarse en la e la fibrosis inducida por tres dosis bisemanales en ratones CD1-nude hembra.

Futuras direcciones

Como análisis necesarias para caracterizar la FP que se podrían realizar a posteriori son las pruebas histológicas de tinción con tricrómico de Masson para la medida del índice Ashcroft, y tinciones específicas como el Sirius red, que tiñe específicamente el colágeno. También se podría realizar una cuantificación de hidroxiprolina para extrapolar la cantidad de colágeno presente en tejido. Otro grupo de determinaciones interesante es la cuantificación por ELISA u otro método, de las citoquinas en la fracción líquida del BAL. Por otro lado, dados los resultados, el estudio del mtDNA en suero podría resultar interesante, como prueba para comprobar la significancia del papel de la función mitocondrial en este modelo.

Materiales y métodos

Manipulación de los animales inmunodeprimidos

Se utilizaron 14 ratones de la cepa “outbred” Swiss CD1 con el genotipo Crl:NU(Ico)-Foxn1^nu/nuque presentan fenotipo desnudo. Estos ratones se manipularon, tanto para realizar el pesaje cada semana como para las intervenciones más invasivas (instilación de bleomicina o vehículo), dentro de campana con flujo laminar y manteniendo las condiciones de esterilidad mediante técnicas de asepsia.

Alojamiento y alimento

Los animales fueron alojados en jaulas de metacrilato autoclavadas con cubierta con filtro, de 4 a 6 animales por jaula. Las jaulas de los animales se depositaron en incubadores de atmósfera cerrada, con flujo de aire filtrado y salida de aire, en condiciones de 25°C y humedad relativa superior al 40% e inferior al 70%. Se les proporcionó dieta estándar y agua filtrada, autoclavados,ad libitum.

Administración de bleomicina/vehículo

La bleomicina o el vehículo (según el grupo experimental) se administró a los ratones mediante instilación intratraqueal a través de una cánula de acero inoxidable de 20 gauge insertada mediante canulación ciega por personal experimentado. La bleomicina (sulfato de bleomicina, Med Chem Express) fue instilada disuelta en una solución estéril de Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) 1X . Se preparó una solución de bleomicina con el objetivo de administrar 6 U/kg de peso corporal equivalente a 4 mg bleomicina/kg corporal. La solución fue administrada en volúmenes variables ajustados al peso de cada ratón, y limitando el volumen instilado a 50 µl.

0,12 ng sulfato de bleomicina/50 µl de DPBS

Reactivo Cantidad para 0,12 ng bleomicina/50 µl DPBS

Sulfato de bleomicina (MedChem Express, New Jersey, Princeton, Estados Unidos)

1,81 mg

DPBS 1X estéril, sin calcio, sin magnesio (biowest, Nuaille,

Francia) 754,17 µl

Tabla 2.Composición/especificaciones de bleomicina y PBS usados.

Sedación

Los animales fueron sedados previo a la instilación de bleomicina con una mezcla de anestésico (ketamina 100 mg/ml, Anesketin, Dechra Veterinary Products S.L.U., Barcelona, España) y sedante (xilacina 20 mg/mL, Sedaxylan, Dechra Veterinary Products S.L.U., Barcelona, España) inyectables, siguiendo una proporción definida (ver Tabla Y). La mezcla fue administrada mediante inyección por vía intraperitoneal.

Proporción Volumen (µl) para 22 ratones (40 µl/30 g de peso corporal)

Concentración final (mg/ml)

Ketamina 100 mg/ml 3 528 60

Xilacina 20 mg/ml 2 352 8

Total 5 880

Tabla 3.Mezcla usada como anestesia.

Sacrificio de los ratones

El sacrificio de los animales se realizó mediante asfixia por dióxido de carbono en cámara sellada. Se llenó la cámara de manera progresiva y continua hasta 1 min desde que se abre la llave de paso del dióxido de carbono. Para evitar inducir estrés por una bajada brusca de la presión parcial de oxígeno se deja ventilar la cámara unos segundos después de cada uso. Posteriormente se procede a la disección del animal, iniciando una laparotomía realizando un corte con la ayuda de tijeras atraumáticas y pinzas con la punta dentada en dirección del eje rostro-caudal desde el extremo inferior del esternón hacia el pubis, repitiendo la misma acción con el tejido conjuntivo y muscular.

Una vez reveladas las entrañas del ratón, después de seccionar y abrir la pared abdominal, se procede a apartar cuidadosamente y con la ayuda de una pinza con la punta curva y plana el tracto digestivo y las glándulas anexas para poder localizar la vena cava abdominal, despejando la zona de

operación. Se procede a la sección de la vena cava abdominal y recogida de sangre venosa, induciendo la hemorragia que interrumpe el flujo sanguíneo.

Fotografía de los pulmones

Se realizaron fotos de los pulmones previa su extirpación con un móvil desde un ángulo que permite el visionado de la superficie pulmonar con el fin de examinar lesiones a nivel macroscópico.

Recogida de muestras

La sangre se recogió por disección de la vena cava abdominal con la ayuda de una jeringa estéril de 1 ml, depositando la sangre extraída en tubos BD Vacutainer ® con EDTA K2, como anticoagulante.

El fluido de lavado broncoalveolar se recogió instilando un total de 1 ml de DPBS estéril 1X en 2 instilaciones de 0,5 ml con jeringas de 1 ml, mantenidas a 4 °C, conservando la esterilidad. Después de introducir 1 ml de DPBS se recogió un volumen aproximado del fluido del lavado con la jeringa estirando suavemente del émbolo para evitar colapsar la tráquea o los bronquios, obteniéndose un volumen ≤ 0,8 ml. Se guardó el contenido de las jeringas en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y se conservaron a 4°Cen agua-hielo para el procesado y análisis posterior. Se recogieron los pulmones, reservando los lóbulos derechos para análisis de biología molecular (RT-qPCR y Western blot) limpiando los pulmones mediante perfusión con DPBS estéril 1X(biowest) mediante punción intramiocárdica con una aguja estéril de 29 gauge y 12,7 mm de longitud (BD Ultra Fine™, Becton, Dickinson and Company) inyectando un volumen de unos 3 ml con una jeringa estéril de 5 ml, perfundiendo hasta notar resistencia en el émbolo, mientras se observa el cambio de color al desplazar la sangre de los vasos sanguíneos del pulmón. Una vez perfundido se procede a ligar el bronquio con hilo y seccionar por debajo de la ligadura, dejando cerrado el bronquio. Los lóbulos se introducen en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml previamente perforado y se congela introduciendo el tubo completamente en nitrógeno líquido (snap freezing) con ayuda de unas pinzas y usando guantes de protección térmicos al manejar nitrógeno líquido en recipiente de cierre hermético. Las vías aéreas inferiores (lóbulo pulmonar izquierdo, bronquio y tráquea inferior), con la exclusión del lóbulo derecho, se perfunden con formaldehido al 4% en metanol absoluto con la ayuda de una aguja y utilizando el catéter intravenoso previamente fijado a la tráquea con una ligadura, realizando esta operación en una campana de gases con flujo laminar y extractor para evitar la potencial inhalación de vapores tóxicos de formaldehido. Posteriormente, el lóbulo izquierdo junto a la tráquea y el corazón se introducen en un casete de plástico para ser incluidos en parafina, que es sumergido en formaldehido al 4% en metanol absoluto. Una porción del hígado también se recoge, almacenándola en un tubo de microcentrífuga previamente perforado, congelando en nitrógeno líquido de forma inmediata.

Las muestras congeladas en nitrógeno líquido se almacenan a -80°C, en ultracongeladores. La sangre en el tubo con anticoagulante se almacena a -20°C.

Citometría de flujo

Del volumen recogido de BAL se reservaron 200 µl para la citometría de flujo, manteniéndose a 4 °C en agua hielo. Se centrifugó el tubo con los 200 µl suavemente a 800 rcf y 4 °C, evitando estresar las células. Se retira el sobrenadante obtenido y se resuspende el pellet en 180 µl de una solución de lisis diluida al 1/10 respecto a la solución comercial (BD Pharm Lyse™ 10X, Becton, Dickinson and Company Lifesciences) de cloruro de amonio para la lisis de los eritrocitos, mejorando así la resolución de los parámetros de dispersión en leucocitos respecto al posible residuo de eritrocitos. Se dejó incubar a temperatura ambiente (unos 24 °C) 5-10 min y se procedió a la citometría de flujo. Se utilizó el citómetro BD FACSVerse™ (Becton, Dickinson and Company Lifesciences, New Jersey, USA) con el software BD FACSuite™ (Becton, Dickinson and Company Lifesciences, New Jersey, USA). Se ajustó el límite de lectura/adquisición en 20.000 eventos, variando la velocidad o flujo del citómetro según la densidad de la muestra de forma automática. Se realizó una lectura previa (Preview) de unos 12 s para verificar que el gating previo se ajusta a las densidades de los grupos a analizar.

Tinción hematoxilina-eosina (H-E) de tejido pulmonar

Los pulmones sumergidos en paraformaldehido se incluyen en parafina y se realizan cortes con el microtomo de 5 µm de grosor a 3 profundidades diferentes del tejido pulmonar incluido, separadas entre sí por 25 µm. Los cortes son desparafinados por calor en una estufa a 60°C. Con los cortes desparafinados se procede a la tinción por método automático con H-E siguiendo el protocolo establecido por el Biobanco Pulmonar del ciberes

(

PNT_8.2.007_v1.1_ES_CORTES HISTOLÓGICOS Y TINCIÓN HEMATOXILINA-EOSINA.pdf

Los cortes teñidos se montaron en un portaobjetos y un cubreobjetos con medio de montaje con resina tipo epoxi.

Análisis semicuantitativo de la fibrosis en cortes H-E de pulmón

Los cortes histológicos montados se visualizan con microscopio (Observer Z1 Axio, Carl Zeiss) asociado a ordenador (Z820 Workstation). Se tomaron de 4 a 5 fotos con un aumento 5X a V de luz (fuente: HAL 1000) de cada corte histológico, definiendo con cada foto un sector del tejido pulmonar.

De cada sector definido se realizaron 2 fotos con un aumento 20X a V de luz. Cada una de estas fotos se analizaron con el software ImageJ (NIH) definiendo un threshold de intensidad de señal (estructuras extracelulares o células) aproximado de 160, definiendo el área ocupada por células o MEC. Con el área ocupada el software cuantifica el área libre obteniéndose un porcentaje de área libre. Macro utilizado en ImageJ:

run("8-bit");

setAutoThreshold("Default dark");

//run("Threshold...");

setAutoThreshold("Triangle dark");

call("ij.plugin.frame.ThresholdAdjuster.setMode", "Red");

setThreshold(178, 255);

run("Measure")

Extracción de RNA de pulmón

Las muestras de pulmón almacenadas a -80°C se transfieren a un recipiente con cierre hermético de nitrógeno líquido. Con las muestras en nitrógeno líquido se procede al pesaje. Se utiliza una tercera parte del total de tejido recogido (unos 80 mg) para la extracción. Al tejido que se utiliza se añaden 800 µl de solución comercial TRItidy G™ (ITW Reagents, PanReac AppliChem) siguiendo un protocolo modificado del protocolo facilitado por la casa comercial. Se homogeneiza hasta no observar trozos de tejido con un homogeneizador manual de aspas () el tejido en TRItidy G™ dentro de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril, manteniendo el tubo a 4°C en agua-hielo. Una vez homogeneizado el tejido se centrifuga durante 1 minuto, a temperatura ambiente y a 2000 rcf para eliminar agregados y restos de tejido sin homogeneizar. El sobrenadante resultado del centrifugado se trasvasa a otro con la ayuda de una micropipeta de 1 ml de volumen variable, dejando incubar durante 5 min a temperatura ambiente. Se añaden 160 µl de 1-bromo-3-cloropropano al sobrenadante mezclando vigorosamente con vórtex, y se incuba 10 min adicionales, pasados los cuales se centrifuga a 12.000 rcf durante 15 min a 4°C. Una vez se han definido las tres fases (en dos de los tubos se produce una inversión de las fases, quedando una fase transparente en el fondo y una fase rosada en la parte superior: tubos #12 y #14), se transfiere la fase superior acuosa a un nuevo tubo de 1,5 ml estéril y se añade un volumen igual al de la fase acuosa obtenida (unos 500 µl) de 2-propanol, se mezcla y se deja incubar 10 min. Se reserva el resto para la extracción de proteína a -20°C. Se centrifuga a 12.000 rcf durante 15 min a 4°C. Posteriormente se realiza un lavado con etanol 75 % con agua libre de RNAsas DEPC, vorteando ligeramente y se vuelve a centrifugar. Una vez centrifugado se elimina el sobrenadante de etanol absoluto, dejando secar el pellet dentro de la campana de gases. Todas las operaciones que impliquen la exposición a fenol (componente del TRItidy) se realizan dentro de campana de gases con extractor, evitando así la exposición a los vapores o aerosoles de fenol.

Una vez seco el pellet se resuspende en 20 µl de agua libre de RNAsas DEPC, ayudándose de la pipeta o incluso requiriendo del uso del vórtex si es necesario.

Cuantificación del RNA

El RNA extraído, disuelto se cuantificó con un espectrofotómetro tipo cuvetteless o sin cubeta (NanoVue Plus, GE Healthcare) utilizando 1 µl del extracto por duplicado, utilizando agua DEPC como blanco en la lectura. Se cuantificó la absorbancia a 260 nm de longitud de onda, verificando la pureza de los extractos de RNA leyendo las muestras también a 230 y 280 nm.

Retrotranscripción (RT)/síntesis de cDNA

Con el extracto de RNA, disuelto en 20 µl de agua DEPC, se preparon volúmenes variables según el resultado obtenido en la cuantificación (Tabla Z) ajustando para obtener una solución de RNA que contenga un total de 500 ng de RNA en 10 µl totales (Tabla XX). Una vez teniendo 10 µl de solución de RNA con 500 ng para cada muestra en tubos de 200 µl no pirogénicos se desnaturaliza el RNA ajustado a 65 °C durante 5 min, en un termociclador (T Professional Thermocycler,Thermo Fisher).

Posteriormente, se realiza un protocolo de retrotranscripción o síntesis de cDNA a partir del RNA.

Para el pipeteo de los reactivos que componen la mezcla para RT se siguió un orden teniendo en cuenta que la transcriptasa inversa (TRANSCRIPTME Reverse Transcriptase (RT32), BLIRT) se encuentra en una solución con glicerol, que evita la congelación (no requiriendo de periodo de descongelación), además de considerar la cinética característica de la transcriptasa inversa (la disponibilidad de dNTPs como factor limitante de la actividad polimerasa), se evita pipetear la mezcla de desoxirribonucleótidos (dNTP MIX 10 mM, BLIRT) hasta haber preparado el resto de componentes. Se añaden 10 µl de mezcla para RT (Tabla 3) a los 10 µl de RNA desnaturalizado y se introducen los tubos tapados en el termociclador siguiendo un protocolo de rampa de temperatura indicado por el fabricante de la trancriptasa inversa con la temperatura óptima (50ºC) (Figura X).

Master mix µL/muestra

10x RT reaction buffer 2

RIBOprotect Rnase inhibitor 1

trasncriptme reverse transcriptase 1

Random Nonamers (50 µM) 1

10mM dNTP MIX 1

agua DEPC 4

template RNA (50ng/µl) 10

Tabla 4.Composición de la mezcla para RT (Master mix)

Figura 13.Temperatura (°C) frente al tiempo (min) en termociclador para protocolo de RT.

El producto de la RT que se obtiene (de volumen total de 20 µl) se diluye 1/10 añadiendo 10 µl de producto de RT en 90 µl de agua DEPC.

qPCR

Para cuantificar la expresión génica (mRNA) fueron realizadas reacciones qPCR con primers específicos para genes de interés, siguiendo una ligera modificación del protocolo especificado por el fabricante del mix de polimerasa con señal tipo 2-step SensiFast SYBR No-ROX (Bioline-Merididan Bioscience). En placas de PCR de plástico transparente con fondo cóncavo se pipetea una mezcla previamente preparada que contiene los reactivos indicados en la tabla inferior (Tabla 5).

Reactivo Concentración solución original Concentración en pocillo Volumen en pocillo

SensiFAST SYBR No-ROX 2-step 2X 1X 5 µl

Agua DEPC 2 µl

Primer Mix

0,5 µl

● Primer forward 10 µM 0,5 µM

● Primer reverse 10 µM 0,5 µM

cDNA 2,5 µl

Total 10 µl Tabla 5.Mezcla para qPCR

La placa es sellada, tapada para evitar la exposición a la luz y centrifugada durante 10 s hasta 2000 rpm, para bajar los reactivos hasta el fondo del pocillo. Después la placa se introduce en el termociclador (C1000 Touch™, Bio-Rad) con un lector de señal en tiempo real (CFX96™ Real-Time System, Bio-Rad) midiendo la fluorescencia emitida por el SYBR Green que contiene el reactivo de PCR, manejado mediante software (CFX Manager™ ver. 3.1, Bio-Rad) programando la lectura y rampa de temperaturas según el protocolo especificado para una qPCR tipo 2-step o de 2 pasos que el fabricante de la Master mix (SensiFAST SYBR No-ROX, bioline) ofrece, ilustrado en la figura inferior (Figura Y). Para el análisis de la expresión de todos los genes con la excepción de Acta2 y Postn se hicieron duplicados, para Acta2 y Postn se pipeteó una única vez el cDNA de cada muestra.

En adición a las muestras se pipetearon dos blancos, un blanco para la RT (mix para RT con agua DEPC, procesado junto a las muestras durante la RT) y para la PCR, sustituyendo el cDNA por agua

DEPC.

Figura 14. Gráfico con la temperatura (ºC) del termociclador frente al tiempo (min), ilustrando la rampa de temperatura inicial requerida para la activación de la polimerasa y las temperaturas en las que se producen las fases de un ciclo (desnaturalización o separación de la doble hebra de DNA, annealing (unión del primer a la

cadena molde) y

elongación), hasta un total de 40 ciclos completos.

Los primers utilizados para las qPCR se listan en la tabla complementaria. Todos poseen una temperatura de melting entorno a los 60 ºC, además de que los amplicones no superan la longitud límite de 400 pb, ubicándose sin excepción por debajo de las 200 pb.

Los primers utilizados en las qPCR están listados en laTabla de primers. Extracción de proteína

Se extrajo la fracción proteica del pulmón siguiendo el protocolo de aislamiento proteico definido por el fabricante del reactivo triple TRItidy G™, modificado para ajustarse a las condiciones de tejido y concentración de proteína. Partiendo de la fracción restante posterior a la extracción de RNA, es decir el infranadante y la fase intermedia, se prosigue con el protocolo separando las proteínas del DNA.

Teniendo en cuenta la presencia de fenol y cloroformo se realizan las operaciones dentro de campana de gases con extracción y flujo de aire. A cada tubo se añaden 240 µl de etanol absoluto (100%), mezclando por inversión varias veces y dejando incubar 5 min a temperatura ambiente.

Posteriormente se centrifuga a 2.000 rcf durante 5 min a 4ºC. El sobrenadante resultado de la centrifugación es el que contiene la fracción proteica, y es transferido con una micropipeta a otro tubo eppendorf. A este último se le añade el doble del volumen presente de isopropanol absoluto (≈1200 µl, según el tubo), dejando incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Una vez la incubación ha acabado se centrifugan los tubos a 12.000 rcf durante 10 min a 4ºC. Se descarta el sobrenadante y se limpia el pellet resultado con 1,6 ml de una solución de hidrocloruro de guanilato al 300 mM en etanol al 95% (v/v). Se mezcla la solución de hidrocloruro de guanilato con el pellet pipeteando suavemente y se deja incubar durante 20 min a temperatura ambiente. Después, los tubos son centrifugados a 7.500 rcf durante 5 min a 4ºC, se descarta el sobrenadante y se vuelve a añadir 1,6 ml de hidrocloruro de guanilato al pellet repitiendo el proceso de centrifugación en las mismas condiciones, realizando los pasos de descarte del sobrenadante, lavado del pellet con hidrocloruro de guanilato y centrifugación un total de 3 veces. Una vez completados los lavados, se apura el volumen

de líquido alrededor del pellet y se procede a evaporar el líquido sobrante, secando el pellet en un concentrador hasta eliminar el líquido. Una vez seco, el pellet se resuspende en una solución de SDS al 1%, pipeteando 1 ml de SDS 1% (p/v). El pellet, por la proporción inicial de tejido y reactivo TRItidy G utilizados, es muy abundante, dificultando su resuspensión incluso calentando a 50ºC y vorteando de manera alternada, 5 min en un bloque térmico y 2 min vorteando los tubos, repitiendo 10 veces el proceso. Debido a la dificultad de resuspensión del pellet, del extracto inicial se recogieron 500 µl, que fueron centrifugados a 12.000 rcf durante 2 min a 4ºC. El sobrenadante resultado fue usado como extracto proteico en las determinaciones.

Cuantificación de proteínas

Para cuantificar el extracto que se obtuvo, tanto inicialmente (extracto con pellet no resuspendido) como con el extracto proteico definitivo, se utilizó el método del BCA o ácido bicinconínico, utilizando un kit comercial con los reactivos y una solución estándar de BSA a 2 mg/ml (bovine serum albumin) (Pierce™ BCA Protein Assay Kit, Thermo Scientific). El ensayo se realizó en placas de 96 pocillos con fondo plano transparente. Las soluciones estándar o de concentración conocida se prepararon pipeteando los siguientes volúmenes de solución de BSA 2 mg/ml y SDS al 10% (p/v):

[BSA] (µg/ml) 0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000

Vol. BSA 2 mg/ml (µl)

0 25 50 75 100 125 150 175 200

Vol. SDS 1% (µl) 200 175 150 125 100 75 50 25 0

Tabla 6.Recta patrón para cuantificación de proteína por método de BCA.

Para la cuantificación tanto de las muestras como de las soluciones estándar se pipetean en la placa 5 µl de la muestra o patrón y µl de una solución de trabajo o working reagent (WR) compuesta de una mezcla 5:1 de reactivo A y reactivo B, del kit comercial. Se agita la placa para mezclar reactivo con muestra/estándar y se deja incubar durante 30 min a 37ºC. Una vez se acaba la incubación, evitando la exposición de la placa a la luz, se agita suavemente y se lee la absorbancia a 562 nm de longitud de onda con la ayuda del lector de placas SYNERGY H1 Microplate Reader y el software Gen5 2.09 configurado para la lectura de placas de 96 pocillos desde el fondo a una longitud de onda de 562 nm.

Preparación de la muestra para Western blot

A partir de la concentración de proteína que se obtiene al cuantificar por el método del BCA se preparan tubos eppendorf que contengan 12,5 µg de proteína, ajustando el volumen en base a la concentración del extracto. Después se le añade tampón de carga (loading buffer) Laemmli 4X, ajustando para que el tampón esté a 1X en el volumen de carga total:

Composición Laemmli buffer 4X Concentración a 4X Concentración en muestra (1X)

Tris base, ajustado a 6,8 pH con HCl 200 mM 50 mM

SDS 8% (p/v) / 277 mM 2% (p/v)

glicerol 40% (v/v) / 4.3 M 10% (v/v)

2-mercaptoetanol 20% (v/v) 5% (v/v)

Azul de bromofenol 0,4% (p/v) / 6 mM 0,1% (p/v)

Tabla 7.Composición de buffer de carga para electroforesis SDS-PAGE.

Añadiendo el 2-mercaptoetanol justo antes de preparar las muestras y dentro de campana de gases.

Una vez se han preparado las muestras se perforan los tubos en el tapón y se colocan sobre bloque térmico previamente precalentado a 95ºC, dejando que la proteína sea desnaturalizada y los puentes S-S reducidos por la acción del mercaptoetanol durante 1 min. Después las muestras se vuelven a colocar en agua-hielo a 4ºC si se han de cargar de manera inmediata o son almacenadas a -20ºC.

Preparación de gel de poliacrilamida para SDS-PAGE