I
Silika nanopartikler endrer morfologi og øker glutamat cystein ligase -
promotoraktiviteten i PC12-celler
Taqwa Farajalla
Masteroppgave i farmasi
Avdeling for farmasøytisk biovitenskap Farmasøytisk institutt
Det matematisk-naturvitenskapelige fakultet
UNIVERSITETET I OSLO
Juni 2015
II
III
Masteroppgave for graden Master i farmasi
Silika nanopartikler endrer morfologi og øker glutamat cystein ligase -
promotoraktiviteten i PC12-celler
Taqwa Farajalla
Oppgaven er utført ved
Avdeling for farmasøytisk biovitenskap Farmasøytisk institutt
Det matematisk-naturvitenskapelige fakultet Universitet i Oslo
Interne veiledere:
Professor Ragnhild Elisabeth Paulsen Postdoktor Kirsten Eline Rakkestad
Ekstern veileder:
Professor II Marit Låg
IV
Copyright Taqwa Farajalla
2015
Silika nanopartikler endrer morfologi og øker glutamat cystein ligase-promotoraktiviteten i PC12-celler
Taqwa Farajalla
http://www.duo.uio.no
Trykk: Reprosentralen, Universitetet i Oslo
V
Forord
Det er alltid noen personer som står bak en suksess.
Først vil jeg takke min mor, far og ektemannen for all støtten jeg fikk i studieårene. Dette har jeg satt stor pris på.
Jeg takker Professor Ragnhild Elisabeth Paulsen og Postdoktor Kirsten Eline Rakkestad for den gode veiledningen og støtten jeg fikk i gjennomføring av denne oppgaven. Jeg må si at jeg aldri kommer til å glemme deres hjelp.
I tillegg vil jeg takke stipendiat Lars Peter Austdal og avdelingsingeniøren Mona Gaarder.
Dere har vært til god hjelp på labben.
Oslo, juni 2015 Taqwa Farajalla
VI
VII
Sammendrag
Effektiv levering av legemidler til hjernen er utfordrende på grunn av beskyttende barrierer.
Blood-hjernebarrieren danner den største hindringen for levering av legemidler til
sentralnervesystemet. Flere metoder for mer effektiv legemiddellevering er derfor i stadig utvikling. Nanopartikler har på grunn av sine unike egenskaper som modifiserbare
partikkeloverflater, stort overflateareal i forhold til volum, ulike strukturer og størrelser og optiske egenskaper evne til å bære ulike legemidler og sørge for effektiv legemiddellevering til hjernen. Silika nanopartikler er biodegraderbare nanopartikler med som syntetiseres lett, er kostnadseffektive, har høyt overflateareal og lett modifiserbar overflate, er reaktive og har høy legemiddelbæreevne. Disse nanopartiklene er formulert for flere medisinske formål inkludert cellulær og ikke-virusbasert genlevering, legemiddellevering, diagnostisering og avbildning i CNS. For at silika nanopartikler skal kunne brukes effektivt må deres
neurotoksisitetsprofil klarlegges og vurderes nøye.
I denne masteroppgaven ble PC12-celler benyttet som modell for å studere eventuelle toksiske effekter av 10 nm og 50 nm silika nanopartikler. Silika nanopartikler har vært involvert i morfologiske forandringer og økt celledød. PC12-celler eksponert for silika nanopartikler ble derfor analysert morfologisk og det ble undersøkt om nanopartiklene ville føre til økt celledød i PC12-celler. I tillegg ble det undersøkt om silika nanopartikler påvirket glutamat cystein ligase-promotoraktiviteten siden de i tidligere studier har vist induksjon av oksidativ stress. Ettersom silika nanopartikler har vært involvert i morfologiske forandringer ble MMP9, Gli og P53-promotoraktiviteten også studert. Noen nanopartikkeltyper har vist å kunne aktivere østrogen kjernereseptorer. Studier av ERE-promotoraktiviteten ble derfor også inkludert. Metoden luciferase reporte assay ble benyttet for promotoraktivitetsstudier.
Både 10 nm og 50 nm silika nanopartikler førte til morfologiske forandringer i form av avlange, trådlignende PC12-celler og begge førte til økt celledød. 10 nm silikananopartikler i lav konsentrasjon økte GCS-promotoraktiviteten og oksidativ stress indusert av silika
nanopartiklene ble foreslått som mekanismen bak dette. Nanopartiklene viste også østrogenlignende effekter og førte til økt aktivitet av østrogenreseptorer.
VIII
Resultater fra denne studien viser en del toksiske effekter mediert av silika nanopartikler.
Dette i tillegg til toksiske effekter rapportert fra andre studier gjør at videre forskning for klargjøring av neurotoksisitetsprofilen er nødvendig.
IX
Forkortelser
ANOVA Variansanalyse (Analysis of variance)
BSA Bovint serum albumin
DMEM Dulbecco´s Modified Eagle´s medium
DMSO Dimetylsulfoksid
DTT Dithiothreitol
ER Østrogen kjernereseptorer
ERE Østrogen responselement
FBS Føtalt kalveserum
HS Hesteserum
MQ Milli Q
NAC N-Acetyl-L-cysteine
NaCl Natriumklorid
NGF Nervevekstfaktor
NP Nanopartikler
P Natriumpyruvat
PBS Fosfatbufret saltvann
PEG Polyethylene glykol
PS Penicillin-Streptomycin
RLU Relativ luminescensenhet
ROS Reaktive oksygenspesier
SE Standardfeil
Si Silika nanopartikler
Si10 Silika nanopartikler med diameter 10 nm
Si50 Silika nanopartikkel med diameter 50 nm
z-DEVD-cmk z-aspartat-glutamat-valin-aspartat-
klormetylketon
X
XI
Innholdsfortegnelse
1 INNLEDNING ... 1
1.1 Sentral nervesystemet ... 1
1.1.1 Barrierer i sentralnervesystemet ... 1
1.1.2 Strategier for levering av legemidler til sentral nervesystemet... 2
1.2 Nanopartikler ... 3
1.2.1 Nanopartikkelbasert legemiddellevering ... 4
1.2.2 Unike egenskaper ved nanopartikler ... 5
1.3 Silika nanopartikler ... 7
1.4 Toksisitet av silika nanopartikler ... 8
1.4.1 Oksidativt stress og GCL ... 8
1.4.2 MMP9 ... 9
1.4.3 Gli ... 9
1.4.4 P53 ... 10
1.4.5 ER ... 11
1.5 Målet med studien ... 12
2 Materialer og metoder ... 13
2.1 Oversikt over kjemikalier, biologiske produkter, nanopartikler og utstyr ... 13
2.2 PC12-celler ... 15
2.2.1 PC12-celler ... 15
2.2.2 Splitting av PC12-celler til flaske ... 15
2.2.3 Splitting av PC12-celler til skåler ... 16
2.2.4 Eksponering av PC12-celler ... 18
2.3 Transfeksjon ... 21
2.3.1 Transfeksjon av PC12-celler ... 22
2.4 Luciferase reporter assay ... 25
2.4.1 Ildflueluciferase ... 25
2.4.2 Høsting av celler til luciferasemåling ... 25
2.4.3 Måling av ildflueluciferaseaktivitet ... 26
2.4.4 Renillaluciferase ... 27
2.4.5 Måling av renillaluciferaseaktivitet ... 28
2.5 Morfometrisk analyse i mikroskop ... 29
2.6 Deteksjon av celledød ... 30
2.6.1 Prosedyre for farging med trypanblå ... 31
2.7 Statistiske analyser ... 32
3 Resultater ... 33
3.1 Morfometrisk analyse... 33
3.2 Celledød ... 44
3.2.1 Celledød ved bruk av batch 1 nanopartikler ... 44
3.2.2 Celledød ved bruk av batch 2 nanopartikler ... 46
3.3 Promotoraktivitet studier ... 47
3.3.1 GCS-promotoraktivitet i silika nanopartikkel eksponerte PC12-celler ... 47
3.3.2 Effekt av silika nanopartikler på MMP9-promotoraktivitet i PC12-celler ... 48
3.3.3 Effekt av silika nanopartikler på Gli-promotoraktivitet i PC12-celler med og uten NAC 51 3.3.4 P53-promotoraktivitet i silika nanopartikkel eksponerte PC12-celler ... 53
XII
3.3.5 Effekt av silika nanopartikler på ERE-promotoraktivitet i PC12-celler ... 54
3.3.6 Effekt av silika nanopartikler på ERE-promotoraktivitet i PC12-celler ... 55
3.4 Celledød ... 56
3.4.1 Celledød ved bruk av batch 1 nanopartikler ... 56
3.4.2 Celledød ved bruk av batch 2 nanopartikler ... 57
4 Diskusjon ... 60
4.1 Diskusjon av metoder ... 60
4.1.1 Valg av PC12-celler som model ... 60
4.1.2 Valg av eksponeringer ... 61
4.1.3 Luciferaseassay som metode for å studere promotoraktivitet... 61
4.1.4 Valg av kvalitativ morfometrisk analyse ... 62
4.1.5 Deteksjon av celledød som endepunkt ... 62
4.2 Diskusjon av biologiske funn ... 63
4.2.1 Morfologisk forandring i silika nanopartikkel eksponerte PC12-celler ... 63
4.2.2 Økt GCS-promotoraktivitet i silika nanopartikkel eksponerte PC12-celler ... 64
4.2.3 Silika nanopartiklers påvirkning på Gli-promotoraktivitet ... 65
4.2.4 Silika nanopartikler viste tendens til å redusere p53-promotoraktiviteten ... 66
4.2.5 Økt ER aktivitet ... 67
5 Konklusjon ... 68
Litteraturliste ... 69
Vedlegg / Appendiks ... 74
1
1 INNLEDNING
Bruk av nanopartikler i medisin, spesielt som legemiddelbærere er i stekt økende grad [1].
Silika nanopartiker har på grunn av sine unike egenskaper potensial for bruk i medisin og aktiv forskning er på gang med tanke på dem som ideelle bærere av legemidler [2].
1.1 Sentral nervesystemet
Hjernen er en av de mest sensitive organene i kroppen. Den er godt beskyttet med flere barrierer som danner strenge begrensninger i passasje av skadelige toksiske stoffer. Til tross for nytten disse barrierene innebærer, er de også et hinder for effektiv levering av legemidler til hjernen. Effektiv behandling av lidelser i sentralnervesystemet (CNS) er derfor
utfordrende [3]. Selv om det finnes effektive legemidler for behandling av en del CNS lidelser, er det begrensninger i levering av disse legemidlene til målstedet i hjernen med en konsentrasjon nødvendig for deres optimale effekt, som gjør at behandling av en del CNS lidelse ikke er under kontroll [4]. Flere metoder for mer effektiv levering av legemidler via systemisk sirkulasjon er derfor i stadig utvikling [3].
1.1.1 Barrierer i sentralnervesystemet
Blod-hjernebarrieren, blod- cerebrospinalvæskebarrieren og blod- tumorbarrieren er
barrierene som begrenser levering av legemidler og effektiv behandling av lidelser i CNS [3].
Blod-hjernebarrieren danner størst hindring for levering av legemidler til CNS [5]. Denne barrieren separerer blodet fra ekstracellulær matriks i hjernen. Tight junctions mellom endotelcellene i blodkapillærer danner grunnlaget for denne barrieren som fører til
begrensninger i passasje av substanser. I utgangspunktet kan bare små molekyler (maksimum 400 Da), små hydrofile substanser (maksimum 150 Da) og lipofile substanser (maksimum 400 Da) diffundere passivt gjennom blod-hjernebarrieren, men det er i tillegg flere andre faktorer som begrenser passasjen. Større molekyler og hydrofile substanser kan bare passere blod-hjernebarrieren via aktive transportsystemer, dersom de har affinitet til disse. Flere
2 effluks pumper som P-glykoprotein pumpen (Pgp), Multidrug resistens assosierte proteiner (MRPs) og brystkreft resistens proteiner (BCRP), i endotel celler begrenser passasje av legemidler til hjernen. Forskjellige protein degraderende enzymer i endotel cellene er også en begrensende faktor [6].
1.1.2 Strategier for levering av legemidler til sentral nervesystemet
To hovedstrategier for levering av legemidler til CNS eksisterer: invasiv og ikke invasiv levering. Oversikt over metoder innen hver strategi er vist på figur1.1.
Figur 1.1 oversikt over strategier og metoder innen hver strategi, for levering av legemidler til CNS. Hovedstrategier deles i invasive og ikke invasive. Invasive metoder er kirurgi, modulering av blod-hjernebarriere permeabilitet og direkte injeksjon av legemiddel til målstedet i hjernen. Ikke invasive metoder er biologisk metode (bruk av legemiddel bærer, nanopartikler), kjemisk modifisering av legemiddel og levering av legemiddel via luktenervene i nesen. Figur er hentet fra [5].
Invasive metoder innebærer fysisk legemiddel levering via kirurgi, direkte injeksjon av legemidler til målstedet eller metoder som modulerer blod-hjernebarriere permeabiliteten slik at legemidler kan passere gjennom barrieren. Disse invasive metodene er risiko fulle og uegnet til flergangsbehandling av lidelser med behov for flere behandlinger.
Ikke invasive metoder innebærer passasje av legemidler gjennom blod-hjernebarrieren uten modulering av barrieren eller transport av legemidler utenom passasje av barrieren, via luktenervene i neseslimhinnen.
legemidler med kjemiske egenskaper som gjør at de ikke er i stand til å passere blod- hjernebarrieren, kan moduleres kjemisk eller syntetiseres i prodrug form som er egnet til å
3 passerer barrieren i en inaktiv form av legemidlet og bli omdannet til aktivt legemiddel i hjernen [7].
En annen ikke invasiv metode utviklet i det siste er levering av legemidler til CNS ved bruk av nanoteknologi, mer spesifikk nanopartikler (NP) [8].
1.2 Nanopartikler
Nanopartikler karakteriseres som partikler med diameter dimensjon som ligger mellom 1 og 100 nanometer størrelse. Dette har stor betydning for NP egenskaper i forhold til større partikler. Figur 1.2 demonstrerer størrelsesorden for en del nanopartikler [9].
Figur 1.2. Sammenligning av størrelsen på en del nanopartikler med kjente stoffer i naturen. [1] liposom, [2] solid–lipid NP, [3] polymer micelle, [4] dendrimer, [5] quantum dot (Qdot) og [6] jernoksid NP i forhold til (fra venstre) vannmolekyl, DNA, bakteriofag, virus, bakterie og nervecelle. Figuren er hentet fra [9].
4
1.2.1 Nanopartikkelbasert legemiddellevering
Målet med formulering av nanopartikler for medisinske formål er ideelle legemiddelbærere med høy sikkerhet som har høy bæreevne, kan effektiv passere fysiologiske barrierer for en spesifikk levering og effektiv behandling av lidelser [10].
På grunn av sine unike egenskaper har NP-er evne til å bære ulike legemidler og sørge for effektiv passasje gjennom blod-hjernebarrieren og levering til hjernen. Denne metoden for transport av legemidler gjennom blod-hjernebarrieren er avhengig av optimalisert
funksjonalisering av NP, ikke modifisering av legemidlers kjemiske egenskaper [8]. Med passende overflatefunksjonalisering kan et legemiddel rettes mot bestemte steder i CNS [6].
Dette er av spesiell betydning for behandling av aggressive hjernetumorer [11].
Legemidler kan assosieres med NP-er, via kovalent binding til NP eller uten kovalent binding (figur 1.3). I assosiasjon uten kovalent binding, kan legemidler enten innkapsles i NP eller sitte stabilt på overflaten. Innkapslet legemiddel frigjøres ved en forandring i Ph, temperatur eller en annen ekstern stimuli, som gjør NP-et permeabel for legemiddel frigjøring. Dersom legemidlet er stabilisert på overflaten kan en forandring i miljøet i kroppen frigjøre
legemidlet, for eksempel et hydrofobt legemiddel frigjøres ved cellemembraner som er hydrofob. Fordeler med transport av legemiddel uten kovalent binding med NP er: 1. det er ikke behov for modifisering av legemiddel, noe som bevarer effektiviteten 2. en optimalisert assosiasjon kan brukes for andre lignende legemidler med samme egenskaper 3. det er ikke behov for en ekstern stimulus for brytning av kovalent binding. Når legemidlet er kovalent bundet til NP må en ekstern stimulus ha ansvaret for å bryte bindingen, men dette innebærer også en fordel da stedsuspesifikk levering hindres [12].
5 Figur 1.3. Nanopartikkelbasert legemiddellevering. A) kovalent eller ikke kovalent
binding. B) Stabilisering av legemiddel på overflaten eller innkapsling. C) faktorer som kan brukes for kontrollert frisetting. Grøn indikerer legemiddel. Gult indikerer NP. Figur hentet fra [12].
1.2.2 Unike egenskaper ved nanopartikler
NP-er har flere unike egenskaper som er ansvarlig for den store oppmerksomheten på deres invaderende rolle i medisin [12].
Modifiserbar partikkeloverflate:
Nanopartikler har modifiserbare overflater som gjør det mulig å designe dem med flere funksjoner for ulike medisinske formål (figur 1.4). Som beskrevet tidligere kan legemidler både innkapsles eller konjugeres på overflaten. Hydrofile surfaktanter som polyetylenglykol
6 (PEG) kan konjugeres på overflaten for å øke partiklenes halveringstid og stabilitet i
blodbanen. Dette begrenser adsorpsjon av proteiner i systemisk sirkulasjon til overflaten, som kan føre til at partiklene oppdages som fremmede legemer og fjernes av retikuloendoteliale systemet, noe som gir partiklene kort halveringstid. Med kovalent binding av ulike
antistoffer, peptider, aptamer (små RNA/DNA molekyler som kan bindes til spesifikke proteiner eller andre målsteder i celler) og kationiske molekyler på NP overflaten kan et legemiddel virke på et spesifikt sted i hjernen. Man kan i tillegg binde fluorescerende prober på overflaten og på denne måten kunne spore legemidlet i hjernen[13] [8].
Figur 1.4 Multifunksjonalisering av nanopartikler. Legemidler kan både innkapsles eller bindes på overflaten av NP. Binding av hydrofile surfaktanter som polyetylenglykol (PEG) øker NP halveringstid. Kovalent binding av antistoffer, peptider, aptamer og kationiske molekyler muliggjør stedspesifikk virkning av legemidler i hjernen. Med binding av fluorescerende prober kan legemidler spores i hjernen. Figur er hentet fra [8].
Stort overflateareal i forhold til volum:
Store partikler har liten overflateareal i forhold til volumet, i tillegg er det en maksimum grense i antall partikler i et bestemt volum. NP-er derimot har stort overflateareal i forhold til volum og de kan syntetiseres i forskjellige størrelser, slik at antall NP-er i et bestemt volum kan justeres ved justering av partikkelstørrelse. Dette har stor betydning for optimalisering av NP-er brukt som legemiddelbærere [12].
Ulik struktur og størrelse:
Nanopartikler kan syntetiseres i forskjellig form og størrelse, egenskaper som har betydning for deres biologiske funksjon. Ulike form på NP-er påvirker opptaket i cellene og ulik
7 størrelse bestemmer deres akkumulering og virkningssted. For eksempel setter NP-er med en viss størrelse seg på ujevne blodårer i tumorer og virker spesifikk på stedet, mens mindre NP- er passerer disse blodårene [12].
Optiske egenskaper:
NP har også unike optiske egenskaper som gjør at de er egnet for avbildning i kroppen [12].
Egenskaper på en ideell nanopartikkel som legemiddelbærer:
Biokompatibilitet er en sentral egenskap
Høy bære eller innkapslings evne
Målstyring og legemiddellevering til spesifikk celle type/vev. Null prematur legemiddel frisetting
Evne til kontrollert legemiddelfrisetting og riktig frisettingshastighet for å oppnå riktig konsentrasjon [14]
1.3 Silika nanopartikler
Silika (SiO2) nanopartikler (SiNP) er biodegraderbare metaloksid nanopartikler med spesielle fysisk og kjemiske egenskaper som gjør dem egnet for flere formål. De er små nanoskala partikler som syntetiseres lett, er kostnadseffektive, har høyt overflateareal og lett
modifiserbar overflate, er høy reaktive og har høy legemiddel bæreevne.
SiNP har blitt utviklet for bruk i blant annet kosmetikk, mekanisk polering, mat og for flere medisinske formål som molekylær avbildning, diagnose, målrettet legemiddel/gen/protein levering, kontrollert legemiddel frigjøring og kreftterapi [10, 15, 16].
For bruk i CNS er SiNP formulert for cellulær og ikke-virusbasert gen levering, legemiddel levering, diagnostisering og avbildning, fordi SiNP er vurdert å ha høyere biokompatibilitet grad enn andre NPer, for eksempel quantom dot som brukes for avbildning og kan inneholde toksiske metaller som kadmium og kvikksølv [17, 18].
For at SiNP skal kunne brukes effektivt må sikkerhet og toksisitetsprofilen klarlegges og vurderes nøye [10]. Disse NP er generelt vurdert som ikke toksiske, men deres neurotoksisitet
8 profil er uklart [16, 17]. Flere in vivo og in vitro studier har rapportert toksiske effekter av SiNP hvor forandring av cellulær morfologi, økt celledød, induksjon av oksidativ stress, aktivering av P53-signalveien og forstyrret cellesyklus er noen av dem [15, 16, 19].
1.4 Toksisitet av silika nanopartikler
1.4.1 Oksidativt stress og GCL
Hjernen er et sensitivt organ mot oksidativ stress og økt nivå av reaktive oksygen radikaler kan føre til nevrodegenerasjon og dermed nevrodegenerative sykdommer som Alzheimer [18]. Rikelighet med umettede fettsyrer i hjernen gjør organet mer utsatt for lipid
peroksidering. I tillegg er det høyt forbruk av oksygen i hjernen og redusert aktivitet av glutation peroksidase [2].
Oksidativ stress i celler oppstår ved ubalanse i produksjon av reaktive oksygen spesies (ROS) og kroppens antioksidant system. En viktig endogen antioksidant er glutation (GSH).
Proteinet syntetiseres i cellene i to trinn der det hastighetsbestemmende enzymet glutamat cystein ligase (GCL) regulerer første trinn i syntesen. Enzymet kalles også gamma-
glutamylcystein syntetase (GCS). Forandring i GCS gen uttrykket fører til forandring i GSH nivået, slik at ved oppregulering av GCS gen øker glutaion syntesen og ved nedregulering reduseres glutation syntesen [20].
Silika nanopartikler har i flere studier vist å kunne føre til oksidativ stress i flere celle typer inkludert SK-N-SH humane neuroblastoma celler, N2a muse neuroblastoma celler, primære mikroglia celler fra rotte og PC12 celler [2, 17, 18, 21]. I PC12-celler har eksponering med SiNP ført til økt produksjon av reaktive oksygenspesier, redusert GSH nivå, økt lipid peroksidering og økt celledød, der lipidperoksidering av celle membraner ble foreslått som mekanismen for oksidativ stress indusert celledød [2].
I en in vivo studie der silika nanopartikler viste størst akkumulering i striatum via intranasalt administrasjon i rotter, førte partiklene til oksidativ stress i striatum [16].
9
1.4.2 MMP9
Matrix metaloprotease-9 (MMP-9) er et medlem i en undergruppe, gelatinaser, av MMP familie av proteolytiske enzymer [22]. Disse proteasene er involvert i remodellering av ekstracellulær matriks både ved normale fysiologiske funksjoner og patologiske tilstander [23]. Under utvikling av CNS er disse enzymene sammen med en del andre enzymer ansvarlig for degradering av ekstracellulær matriks for å muliggjøre neuronal migrasjon og nevrittutvekst.
I tillegg ved skade i perifere nevroner induseres uttrykket av MMP9 i schwann celler og makrofager som muliggjør gjenopprettelse av nevroner og aksoner [24]. I en studie hvor PC12 celler ble brukt som model for å studere MMP9 rolle i nevrittutvekst, ble akkumulering av MMP9 i skadete nevroner påvist og studien konkluderte med at MMP9 har en sentral rolle i nevritt utvekst. [25].
Flere studier har vist økt MMP9 nivå i metastaserende tumorer. Degradering av ekstra cellulær matriks rundt tumorer gir dem mulighet til å spre seg [26].
MMP-9 er ikke konstitutivt uttrykk. Promotorregionen i denne proteasen inneholder aktivator protein-1 sekvens (AP-1) [23]. AP-1 er en transkripsjonsfaktor som består av heterodimer proteiner fra jun og fos protein familien. Komplekset bindes til AP-1 bindingssete og regulerer gen transkripsjonen. Flere faktorer kan indusere jun og fos genuttrykket, for eksempel inflammatoriske cytokiner og onkogene produkter [23, 27].
Silika NP har i en studie vist å kunne føre til morfologiske forandringer i PC12 celler og påvirke nevritt utvekst. I studien hadde NGF+SiNP eksponerte PC12 celler mistet evnen til å utvikle modne nevritter i forhold til celler bare eksponert for NGF [2].
1.4.3 Gli
Gli er en familie av tre transkripsjonsfaktorer involvert i sonic hedgehog signalveien, en nødvendig signalvei for riktig utvikling av organer, inkludert CNS, under organogenesen [28]. I fullt utviklet CNS har signalveien sentral rolle for vedlikehold av neuronal stamceller [29].
10 På cellenivå er signalveien viktig for celle proliferasjon og forstyrrelser i signalveien kan føre til ukontrollert celle proliferasjon som kan ende i tumorutvikling [30]. Sonic hedgehog signalveien har også vist å fremme tumor metastasering ved å redusere uttrykket av E- cadherin (transmembran proteiner som fører til binding av naboceller ved at de bindes til hverandre) og øke uttrykket av snail protein (transkripsjonsfaktor som hemmer E-cadherin uttryk) [30-32].
Signalveien aktiveres ved at sonic hedgehog proteiner setter seg på PTCH1 transmembran reseptorer som da aktiverer smoothened reseptorer. Aktiverte smoothened reseptorer fører til fosforylering av Gli som translokkeres til celle kjerne, bindes til promotor region av gener og regulerer transkripsjonen [28]. Gli 1 og Gli 2 virker som transkripsjonsaktivatorer, mens Gli 3 virker som transkripsjonssupressor. De fleste gener regulert av sonic hedgehog signalveien har gli1 sekvens og reguleres av Gli1 som er hovedfaktoren i signalveien. Gli1 er involvert i regulering av celle proliferasjon og celleorganisering [30].
1.4.4 P53
P53 er en transkripsjonsfaktor som ved oksidativ stress i celler og DNAskade har en beskyttelses rolle på genomet [33]. P53 blir også referert til som et tumorsuppressorgen. I omtrent 50% av krefttilfellene har man sett mutasjoner i p53 genet, derfor har p53 aktivitet fått et særplass i flere studier [34]. Aktivering av p53 ved oksidativt stress eller DNA skader fører via flere mekanismer til enten apoptose eller reversibel arrestering av cellesyklus, reparasjon og celle proliferasjon igjen, viktige prosesser for hindring av tumor utvikling.
Flere gener ansvarlige for apoptose eller arrestering av cellesyklus er responsive til p53 regulering og kan både nedreguleres eller oppreguleres [33]. Aktivert p53 aktiverer uttrykk av Bax, et proapoptotisk protein og medlem i Bcl-2 familien, og nedregulerer utrykk av antiapoptotisk Bcl-2. Dett fører til frigjøring av cytokrom c og medfølgende caspase-3- aktivering som ender i apoptose [19]. Ved store oksidative skader oppreguleres apoptotiske gener, mens ved moderate skader på DNA oppreguleres gener ansvarlige for arrestering av cellesyklus.
I CNS har p53 i tillegg til regulering av nevronal apoptose og DNA reparasjon, en sentral rolle i nevritt utvekst og aksonal regenerasjon. Transkripsjonsfaktoren p53 regulerer utrykk av aktinbindende proteinet coronin 1b og GTPasen Rab 13, to nødvendige proteiner for nevrittutvekst. I en studie hvor PC12 celler ble brukt som model viste celler eksponert for
11 nervevekstfaktor (NGF) ved fravær av p53 ikke utvikling i nevritt utvekst i forhold til NGF eksponerte celler med tilstedværelse av p53. Transkripsjonsfaktoren er derfor en nødvendig faktor for NGF mediert nevrittutvekst i PC12 celler. Samme studie viser nødvendigheten av p53 for nevtittutvekst og modning av embryonale kortikal nevroner fra rotte [35].
Silika NP har vist å kunne aktivere p53 og en del andre signalveier via oksidativ stress. I en studie har eksponering av endotelceller med SiNP, med tanke på at partiklene har en direkte kontakt med endotel celler i sirkulasjonssystemet, vist å kunne indusere produksjon av reaktive oksygen radikaler med medfølgende aktivering av p53, endotelcelle dysfunksjon og apoptose [19]. I en annen studie har SiNP via induksjon av oksidativ stress i PC12 celler, vist et doseavhengig uttrykk av p21 og Gadd45 proteinene som aktiveres av p53 og regulerer arrestering av celle syklus. Det var i tillegg økt uttrykk av bax og redusert uttrykk av bcl-2 som da fører til apoptose [16].
1.4.5 ER
Hormonet østrogen er et viktig hormon for riktig funksjon av flere organer, inkludert CNS.
Hormonet medierer sin effekt via østrogen kjernereseptorer (ER), viktige
transkripsjonsfaktorer som regulerer transkripsjon av flere gener. Disse reseptorene kan aktiveres av hormonene 17α- østradiol, 17β-østradiol og en del andre faktorer involvert i andre signalveier. 17β-østradiol er det mest aktive østrogenet som har sterkere affinitet for østrogen reseptorer. Dette hormonet syntetiseres i flere organer inkludert hjerne [36]. 17β- østradiol medierer sin effekt via binding til østrogen reseptorer i cytoplasma, som da fører til aktivering av reseptoren som translokeres til kjernen, binder seg til østrogen responselement (ERE) i promotorregion og regulerer transkripsjon av flere gener [37].
En del nanopartikler og miljøtoksiner er vist å kunne aktivere østrogen reseptorer på samme måte som østrogener [38, 39]. En studie viste at nanopartikler fra dieseleksos kunne aktivere ER i MCF-7 celler (en brystkreft cellelinje) og føre til stimulering av celleproliferasjon på samme måte som 17β-østradiol [39].
12
1.5 Målet med studien
Hovedmål:
Undersøke videre uønskede effekter av silika nanopartikler i PC12-celler.
Delmål:
1. Undersøke eventuelle forandringer i PC12-cellers morfologi ved eksponering for silika nanopartikler.
2. Undersøke om silika nanopartikler fører til økt celledød i PC12-celler og videre prøve å finne ut ansvarlig signalvei for celledød.
3. Undersøke om silika nanopartikler påvirker GCS, MMP9, Gli, P53 og ERE- promotoraktiviteten.
13
2 Materialer og metoder
2.1 Oversikt over kjemikalier, biologiske produkter, nanopartikler og utstyr
Tabell 2.1 Kjemikalier og biologiske produkter
Produkt Leverandør
L-Ascorbic acid Sigma- Aldrich, St.Louis, USA
Bovint serumalbumin (BSA) (A9418) Sigma- Aldrich, St.Louis, USA Dithiothreitol (DTT) Sigma- Aldrich, St.Louis, USA
DMSO Sigma- Aldrich, St.Louis, USA
Dulbecco´s Modified Eagle´s medium (DMEM)
Gibco, Life Technologies, Carlsbad, USA Dual Luciferase Reporter Assay System Promega Corporation, USA
Etanol (absolutt alkohol prima) Kemetyl Norge AS, Vestby, Norge Føtalt kalveserum (FBS) Lonza, Walkersville, USA
Glutamin Sigma- Aldrich, St.Louis, USA
Hesteserum (HS) Gibco, Life Technologies, Carlsbad, USA
D-luciferin Duchefa Biochemistry, Nederland
Metafectene ® Pro Biontex laboratories, Tyskland
N-Acetyl-L-cysteine (NAC) Sigma-adrich,
Natriumklorid (NaCl) Merck KGaA Darmstad, Tyskland
Natriumpyruvat Gibco, Life Technologies, Carlsbad, USA
NGF (nervevekstfaktor) Sigma- Aldrich, St.Louis, USA Penicillin-Streptomycin (10 000 U/ml- 10
mg/ml)
Gibco, Life Technologies, Carlsbad, USA
Raloxifene Tocris, Bristol, England
SB 202190 (P38-hemmer) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Triton Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Trypanblå Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
14 (±)-α-Tocopherol Sigma-Aldrich, St.Louis, USA
z-DEVD-cmk (Caspase-3-hemmer) Bachem AG, Bubendorf, Sveits
Tabell 2.2 Nanopartikler
Nanopartikkel Leverandør
Si10 Kisker Biotech GmbH & Co. KG, Steinfort,
Germany
Si50 Kisker Biotech GmbH & Co. KG, Steinfort,
Germany
Tabell 2.3 Utstyr
Utstyr Leverandør
Cellekulturflaske 75 cm2 Nunc ™, Danmark Cellekulturskåler 8,8 cm2 og 21,5 cm2 Nunc ™, Danmark
Celleskrape Corning Incorporated, USA
CO2-inkubatorskap Thermo Scientific Rockford, USA
Gassbrenner Fireboy eco, Integra Biosciences Zizers,
Sveits
Tellekammer neubauer
Kamera til lysmikroskop Spot, USA
Kjølesentrifuge (Hergeus Fresco 21) Thermo Scientific, Rockford, USA
Varmeapparat 37 °C Grant, England
LAF-benk (Holten LaminAir, modell 1.2) Eco Holten AS, Danmark Luminometer (Lumat LB 9507) EG&G, Tyskland
Lysmikroskop (TMS 2.2.1) Nikon, Japan
Magnetrører RCT basic, IKA Labortechnic,
Tyskland
Pasteurpipette Thermo Scientific, Rockford, USA
Pipetboy Integra Bioscience, Zizers, Sveits
Pipetter Corning Incorporated, Mexico
15
Pipettespiser Sartoorius Biohit, Helsinki, Finland
Rør til å sette i luminometer Sarstedt, Tyskland
Sterilfilter 0,2 μm Whatman, Tyskland
Sonikator Sonics & Materials, Inc. Newtown, USA
Vannbad (Sub Aqua 12) Grant, England
Vekt Sartorius, Goettingen, Tyskland
Whirlmixer (M52 Minishaker) Tamro Lab. AS, Sverige
2.2 PC12-celler
2.2.1 PC12-celler
PC12-celler er en klonet nevronal cellelinje som stammer fra et feokromocytom i rottebinyre [40]. Disse cellene uttrykker reseptorer for en del vekstfaktorer inkludert NGF og kan i nærvær av dette differensiere og få nevronliknende egenskaper. Denne effekten er reversibel ved fjerning av NGF [41].
2.2.2 Splitting av PC12-celler til flaske
PC12-celler splittes normalt 2 ganger i uken, når de har nådd konfluent tetthet. LAF-benk brukes for å utføre splitting. Cellene dyrkes i celleflaske med PC12-cellekulturmedium (tabell 2.4) og inkuberes i inkubatorskap ved 37°C og 5% CO2.
Prosedyre for splitting av PC12-celler til flaske:
1. Cellene observeres i lysmikroskop for å se om de har nådd konfluent tetthet.
2. Cellemedium helles av flasken.
3. 10 ml nytt PC12-cellemedium tilsettes cellene. For at cellene skal løsnes fra flaskebunnen og blandes med mediumet, bankes det godt på sidene og i bunnen av celleflasken. En annen måte som gjør det lettere å løsne cellene er å tilsette 5 ml nytt PC12-medium først og tilsette resten av mediumet som er 5ml etter at cellene har
16 løsnet. Slik får man mindre volum av cellesuspensjonen under splitting som gjør prosessen lettere og raskere.
4. Både lang pipette og pasteurpipette kan brukes for å løsne cellene. Det pipetteres først 10 ganger opp og ned med langpipette og deretter 10 ganger ved bruk av
pasteurpipette med innskrenket åpning.
5. Cellene inspiseres under lysmikroskop for å se om celleaggregater er løst opp og jevn homogen cellesuspensjon er dannet. Prosessen gjentas ved observasjon av
celleaggregater.
6. Hver ny celleflaske tilsettes 1,5 ml cellesuspensjon og 20 ml PC12-medium.
Celleflaskene merkes med antall pasasjer.
2.2.3 Splitting av PC12-celler til skåler
Prosedyre for splitting av PC12-celler til skåler:
1. Cellene behandles som beskrevet i trinnene 1-5 over.
2. Celletettheten må bestemmes ved splitting til skåler. Derfor tas en liten mengde cellesuspensjon og settes på et haemocytometer (Neubauer).
3. Lysmikroskop brukes for telling av antall celler i 2 ruter. Gjennomsnittet av antall celler i rutene registreres som antall celler talt.
Ønsket celletetthet for både små og medium skåler er 7,0 x 104 celler/ml.
4. Mengde cellesuspensjon som trenges til skålene overføres til en kolbe og blandes med nytt PC12 medium:
Formlene under anvendes for å beregne mengde cellesuspensjon og mengde PC12-medium:
Mengde cellesuspensjon (ml) =
antall ml per skål x antall skåler x (7,0x104 celler/ml) antall celler i tellekammer x 104
17 Mengde PC12-medium (ml) = (antall ml/skål x antall skåler) - antall ml cellesuspensjon
5. PC12-medium og cellesuspensjonen blandes godt for å få en jevn fordeling av cellene. Deretter overføres passende mengde til sterile cellekultur skåler. Mengde cellesuspensjon som trenges for skåler med forskjellige størrelser er angitt i tabell 2.6.
Små skåler (8,8 cm2) ble brukt til dyrkning av celler til promotorstudier og morfometrisk analyse og medium skåler (21,5 cm2) ble brukt til deteksjon av celledød.
6. Dyrkede celler inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2.
PC12-medium med serum
Alle komponentene som står i tabell 2.4 blandes i en 500 ml Dulbecco´s Modified Eagle´s medium (DMEM) flaske. Natriumpyruvat (P) og Penicillin-Streptomycin (PS) sterilfiltreres ved hjelp av sprøyte og sterilfilter, før blanding. Arbeidet utføres i LAF-benk. Mediet oppbevares ved 2-8 °C.
Tabell 2.4 Oversikt over komponenter brukt for produksjon av PC12-medium med serum
Komponent Mengde Konsentrasjon
Dulbecco´s Modified Eagle´s medium (DMEM) 500 ml
Føtalt kalveserum (FBS) 50 ml 10%
Hesteserum (HS) 25 ml 5%
Glutamin 10 ml 2 mM
Natriumpyruvat (P) 5 ml 1 mM
Penicillin-Streptomycin (PS) (10 000 U/ml-10 mg/ml )
5 ml 100 U/ml-0,1 mg/ml
PC12 medium uten serum produseres uten FBS og HS
18 Tabell 2.5 Oversikt over serum brukt for produksjon av PC12-medium
Serum Lot-nr Katalognr. Leverandør
Hesteserum 1131917 16050-122 Gibco, USA
Føtalt kalveserum OSB017 DE14-801F Lonza, USA
Tabell 2.6 Mengde cellesuspensjon per skål
Skål Størrelse Mengde (ml)
Små 8,8 cm2 1 ml
Medium 21,5 cm2 3,3 ml
2.2.4 Eksponering av PC12-celler
PC12-celler ble eksponert for silika nanopartikler på to størrelser, 10 nm (Si10) og 50 nm (Si50) og ulike faktorer (tabell 2.7- 2.9). Eksponering av PC12-celler til
promotoraktivitetstudier ble utført 24 timer etter transfeksjon av cellene som tilsvarer 48 timer etter utplating. PC12-celler brukt til telling av celledød og morfometrisk analyse ble eksponert 24 timer etter utplating. Serumfritt PC12-medium ble brukt sammen med silika nanopartikler og som kontroll i ueksponerte skåler (tabell 2.4). For å få en jevn silika nanopartikkel suspensjon før eksponering ble suspensjonen rystet godt ved bruk av
wirlmikser. Eksponeringsløsningene ble tilsatt forsiktig på kanten av skålene for å ikke skylle vekk cellene. Eksponering ble gjort i LAF-benk og eksponerte celler sto i inkubatorskap ved 37 °C og 5 % CO2. Inkubasjonstid for eksponerte skåler til promotoraktivitet studier var 24 timer og for eksponerte skåler til deteksjon av celledød 48 timer. Eksponerte skåler til morfometrisk analyse ble inkubert i 24, 48 og 72 timer.
Preparering av silika nanopartikkelløsning
Si10 og Si50 nanopartikkel stamløsninger benyttet i denne masteroppgaven ble levert av leverandøren i konsentrasjon 25 mg/ml. 920 μl stamløsning ble fortynnet med 9,08 ml sterilt
19 H2O til konsentrasjon 2,3 mg/ml. Denne fortynningen og rekkefølgen i
prepareringsprosedyren er optimalisert av [42].
Sluttkonsentrasjon av SiNP var 2 mg/ml med 0,15 % BSA og 1 X PBS.
Prosedyre for preparering av nanopartikkelløsning :
1. 1 ml fortynnet nanopartikkelløsning (2,3 mg/ml) sonikeres i sonikator med 420 kJ/ml og amplitude 50.
2. 34,5 μl BSA (50 mg/ml) tilsettes partikkelløsningen.
3. Deretter tilsettes 115 μl 10 X PBS.
4. Partikkelløsning blandes i wirlmikser.
Tabell 2.7 Oversikt over eksponeringer av PC12-celler til promotoraktivitet studier
Medium Eksponering av PC12-celler
PC12 medium med serum Ueksponert
Ueksponert + NAC (250 μM) Ueksponert + Raloxifene (0,1 μM) PC12 medium uten serum Ueksponert
Ueksponert + NAC (250 μM) Ueksponert + Raloxifene (0,1 μM) 17beta-østradiol (10 μM )
17beta-østradiol (10 μM ) + Raloxifene (0,1 μM) Si10 (12,5 μg/ml )
Si10 (25 μg/ml) Si10 (50 μg/ml )
Si10 (25 μg/ml) + NAC (250 μM) Si10 (25 μg/ml) + Raloxifene (0,1 μM) Si50 (25 μg/ml)
Si50 (50 μg/ml) Si50 (100 μg/ml)
20 Si50 (50 μg/ml) + NAC (250 μM)
Si50 (50 μg/ml) + Raloxifene (0,1 μM)
Tabell 2.8 Oversikt over eksponeringer av PC12-celler til morfometrisk analyse
Medium Eksponering av PC12-celler
PC12 medium med serum Ueksponert
Ueksponert + NGF PC12 medium uten serum Ueksponert
Ueksponert + NGF Si10 (25 μg/ml) Si50 (50 μg/ml)
Tabell 2.9 Oversikt over eksponeringer av PC12-celler til deteksjon av celledød
Medium Ekospnering av PC12-celler
PC12 medium med serum Ueksponert
Ueksponert + NAC (250 μM) Ueksponert + SB 202190 (20 μM) Ueksponert + Raloxifene (0,1 μM) Ueksponert + z-DEVD-cmk (1 μM)
Ueksponert + Vitamin C (2 μM) og Vitamin E (10 μM) PC12 medium uten serum Ueksponert
Ueksponert + NAC (250 μM) Ueksponert + SB 202190 (20 μM) Ueksponert + Raloxifene (0,1 μM) Ueksponert + z-DEVD-cmk (1 μM)
Ueksponert + Vitamin C (2 μM) og Vitamin E (10 μM) Si10 (12,5 μg/ml)
Si10 (25 μg/ml) Si10 (50 μg/ml) Si10 (100 μg/ml)
21 Si10 (25 μg/ml) + NAC (250 μM)
Si10 (25 μg/ml) + SB 202190 (20 μM) Si10 (25 μg/ml) + Raloxifene (0,1 μM) Si10 (25 μg/ml) + z-DEVD-cmk (1 μM)
Si10 (25 μg/ml) + Vitamin C (2 μM) og Vitamin E (10 μM) Si10 (100 μg/ml) + NAC (250 μM)
Si10 (100 μg/ml) + SB 202190 (20 μM) Si10 (100 μg/ml) + Raloxifene (0,1 μM) Si50 (25 μg/ml)
Si50 (50 μg/ml) Si50 (100 μg/ml) Si50 (200 μg/ml)
Si50 (50 μg/ml) + NAC (250 μM) Si50 (100 μg/ml) + NAC (250 μM) Si50 (100 μg/ml) + SB 202190 (20 μM) Si50 (100 μg/ml) + Raloxifene (0,1 μM) Si50 (100 μg/ml) + z-DEVD-cmk (1 μM)
Si50 (100 μg/ml) + Vitamin C (2 μM) og Vitamin E (10 μM)
2.3 Transfeksjon
For transfeksjon innkapsles DNA i liposom og tilsettes cellene. Liposomet setter seg på cellemembraner og smelter sammen med dem. Dette fører til levering av genetisk materiale til cytoplasma og deretter translokeres til kjernen og kan bli uttrykt (figur 2.1). I dette studiet ble Metafectene ® Pro brukt som transfeksjonreagens. Metafectene ® Pro er liposomer som består av kationiske og nøytrale lipider [43].
22 Figur 2.1 Transfeksjon. DNA innkapsles i liposom og tilsettes cellene. Liposomet setter seg på cellemembraner og smelter sammen med dem. Genetisk materiale leveres til cytoplasma og deretter translokeres til kjernen og blir uttrykt. Figur er hentet fra [44].
2.3.1 Transfeksjon av PC12-celler
Transfeksjon av PC12-celler med Metafectene ® Pro ble gjennomført 24 timer etter utplating av celler i små skåler. Hver skål tilsettes 1,1 μg DNA hvorav 0,1 μg er internstandarden renillaluciferase under kontroll av thymidinkinasepromotor (rl-tk), og 2 μl Metafectene ® Pro. Prosessen ble gjennomført i LAF-benk. Skålene sto i inkubatorskap ved 37 °C og 5 % CO2 etter transfeksjon.
Prosedyre for transfeksjon av PC12-celler med Metafectene ® Pro:
23 1. Mengde serumfritt PC12-medium og DNA som trenges for alle skålene beregnes med
formlene under.
Mengde serumfritt PC12-medium = 100 μl serumfritt PC12-medium x antall skåler Mengde ildflueluciferase plasmid = 1 μg ildflueluciferase x antall skåler
Mengde rl-tk = 0,1 μg rl-tk x antall skåler
2. Halvparten av mediumet tilsettes forsiktig Metafectene ® Pro. Blandingen beveges forsiktig opp og ned 2 ganger.
3. Halvparten av mediumet tilsettes DNA og blandes godt ved bruk av wirlmikser.
Mengde DNA som trenges beregnes med formlene under.
4. Metafectene ® Pro løsning og DNA løsning blandes forsiktig sammen ved å bevege blandingen opp og ned forsiktig 1 gang.
5. Løsningen inkuberes i 20 minutter ved romtemperatur.
6. Overfører 100 μl løsning til hver skål med medium. For å få jevn fordeling av løsning i skålene dryppes forsiktig 50 μl løsning til alle skålene først og deretter gjentas prosessen med 50 μl løsning.
7. Cellene legges til inkubasjon i inkubatorskap ved 37 °C og 5 % CO2.
8. Transfeksjonsløsning erstattes med PC12-medium med serum etter 5 timer.
24 Tabell 2.10 Plasmider brukt for transfeksjon av PC12-celler
Plasmid Plasmidets
forkortelse
Konsentrasjon per skål
Leverandør
Ildflueluciferase under kontroll av GCS-promotor
GCS-luc 1 μg / ml Gave fra
R.Blomhoff, UiO
Ildflueluciferase under kontroll av P53-response element
P53 1 μg /ml Addgene
Ildflueluciferase under kontroll av MMP9-promotor
MMP9-luc 1 μg /ml Gave fra
Mikola - UIT
Ildflueluciferase under kontroll av Gli-response element
Gli-luc 1 μg /ml Riken, Japan
Ildflueluciferase under kontroll av
østrogen response element
ERE-luc 0,5 μg /ml Gave fra
Milbrandt, Washington Universitet, St.
Louis, USA
Østrogen reseptor ER 0,5 μg /ml Gave fra
Milbrandt, Washington Universitet, St.
Louis, USA Renillaluciferase under
kontroll av
thymidinkinasepromotor
rl-tk 0,1 μg /ml Promega
Corporation, USA
25
2.4 Luciferase reporter assay
2.4.1 Ildflueluciferase
Ildflueluciferase er et enzym som katalyserer oksidasjon av luciferin i nærvær av ATP, Mg2 og O2. Reaksjonen resulterer i emisjon av fotoner som detekteres i form av lysproduksjon.
Lysintensiteten måles i et luminometer.
I luciferase reporter assay er reporter gen for ildflueluciferase koblet til promotor som man ønsker å studere aktiviteten på. Graden av reporter genuttrykket som måles i form av lysintensitet, har en direkte sammenheng med promotoraktiviteten [45].
Metoden gir mulighet for å studere aktiviteten av ulike promotorer i ulike celletyper in vitro.
2.4.2 Høsting av celler til luciferasemåling
Transfekterte og eksponerte celler høstes 24 timer etter eksponering som tilsvarer 48 timer etter transfeksjon.
For høsting av celler er det behov for 0,1% LUC med 1mM DTT (tabell 2.11 ) og PBS (tabell 2.12). Løsningene må settes på is.
Prosedyre for høsting av PC12-celler til luciferasemåling : 1. Vekstmediet i skålene tømmes av.
2. Skålene vaskes med 1 ml PBS x 2. PBS rester fjernes med pipette etter andre vask.
3. En løsning av 0,1% LUC med 1 mM DTT lages.135 μl av løsningen tilsettes midt på skålen.
4. Skålene settes til inkubasjon ved romtemperatur i 5 minutter.
5. Cellene skrapes med en celleskraper i to retninger vinkelrett på hverandre.
Celleskraper vaskes med PBS etter skraping av hver skål for å unngå påvirkning mellom skålene.
6. Cellesuspensjonen overføres til eppendorfrør.
7. Eppendorfrørene sentrifugeres i en kjølesentrifuge ved 4 °C og 13000 rpm (revolutions per minute) x 16200 g i 5 minutter.
26 Tabell 2.11 Oversikt over innholdsstoffer for løsninger brukt ved høsting av celler til luciferasemåling
Løsning Innholdsstoffer Mengde
0,1% LUC
Oppbevares ved 2-8 °C
1 M Tris – 1 M MES pH 7,8 Triton X-100
MQ-vann (romtemperert)
5 ml 0,1 ml 95 ml
1 M DTT
Oppbevares ved -20 °C
Dithiothreitol MQ-vann
154,4 mg 1,0 ml
Tabell 2.12 PBS løsning
Løsning Innholdsstoffer Mendge Sluttkonsentrasjon
PBS (fosfatbufret saltvann)
Justeres til pH 7,4 med HCl/NaOH og autoklaveres
Oppbevares kjølig
NaCl KCl KH2PO4
NaHPO4x2H2O MQ-vann
32,0 g 0,8 g 1,08 g 7,12 g ad 4000 ml
138 mM 2,7 mM 2 mM 10 mM
2.4.3 Måling av ildflueluciferaseaktivitet
For måling av ildflueluciferaseaktivitet er det behov for 1mM luciferin (tabell 2.13) og LUC- coctail (tabell 2.14 ). Løsningene må settes på is.
Prosedyre for måling av ildflueluciferaseaktivitet:
1. Supernatanten overføres til nye eppendorfrør.
27 2. 50 μl av cellesuspensjonen blandes med 150 μl LUC-coctail. Spesielle rør som kan
settes i luminometeret brukes.
3. Blandingen settes i luminometer som måler lysintensiteten på 2 sekunder.
Luciferinløsningen overføres til blandingen via en dispenser.
Tabell 2.13 1mM luciferin løsning brukt ved måling av ildflueluciferaseaktivitet
Løsning Innholdsstoffer Mengde
1mM luciferin
Beskyttes mot lys ved bruk av folie
Oppbevares i kjøleskap
D-luciferin MQ-vann
11 mg 36,7 ml
Tabell 2.14 LUC-coctail løsning brukt ved måling av ildflueluciferaseaktivitet
Løsning Innholdsstoffer Mengde
LUC-coctail
Oppbevares ved -20 °C
Adenosin 5-trifosfat (ATP) Magnesiumacetat 1 M 1 M Tris – 1M MES pH 7,8 MQ-vann
240 mg 2 ml 8,3 ml 89,7 ml
2.4.4 Renillaluciferase
For korrigering av variasjonen som kan skje i de ulike cellebehandlingstrinnene, er det viktig å bruke internstandard. I denne masteroppgaven er renillaluciferase under kontroll av
thymidinkinasepromotor (rl-tk) benyttet som intern standard i luciferase reporter assay metoden. Reportergen for enzymet renillaluciferase er koblet til en konstitutiv
thymidinkinasepromotor som ikke lar seg forstyrres av variasjon som følge av behandling av cellene. Antall celler og transfeksjonseffektivitet er eksempler på parametere som kan variere [45]. Enzymet er en katalysator av coelenterazine (renilla luciferin) oksidasjon som utføres i
28 nærvær av O2 og resulterer i lysproduksjon [46]. Lysintensitet detekteres av luminometer og benyttes som mål for promotoraktivitet.
2.4.5 Måling av renillaluciferaseaktivitet
Prosedyre for måling av renillaluciferaseaktivitet :
1. 9,9 ml MQ-vann blandes med 100 μl Stop&Glo®-reagens (tabell 2.15). Wirlmikser benyttes for blanding og blandingen beskyttes mot lys ved bruk av folie.
2. Luminometer innstilles på programmet til måling av renillaluciferaseaktivitet.
Lysintensiteten måles på 10 sekunder.
3. 100 μl fortynnet Stop&Glo®-reagens blandes med supernatant fra cellehøsting.
Spesielle rør til å sette i luminometer benyttes. Passende volum for testing av renillaluciferaseaktivitet bestemmes ved å finne volumet som ligger i det lineære området. Dette gjøres ved å teste for eksempel 2,5 μl, 5,0 μl og 7,5 μl supernatant fra cellehøstingen og se etter dobling av renillaluciferaseaktivitet ved dobling av volum.
4. Hver prøve måles flere ganger til man finner minst tre verdier med maksimum 10%
forskjell. Gjennomsnittet av disse verdiene benyttes som resultat.
Tabell 2.15 Stop&Glo®-reagens benyttet til måling av renillaluciferaseaktivitet
Løsning Innholdsstoffer Mengde
Stop&Glo®-reagens
Oppbevares ved -20 °C
Stop&Glo®-substrat Stop&Glo®-buffer
20 μl 1 ml
29
2.5 Morfometrisk analyse i mikroskop
PC12-celler ble dyrket i små skåler (8,8 cm 2) og inkubert ved 37 °C og 5 % CO2 i 24 timer.
Celler ble eksponert for Si10 og Si50 nanopartikler. Serumfritt PC12-medium ble benyttet for eksponerte celler og ubehandlede kontrollceller. PC12-medium med serum ble brukt som kontroll for effekten av serumdeprivasjon. Cellenes utseende ble studert under Nikon
lysmikroskop og bilder fra et passende synsfelt ble tatt med et kamera (Spot) som er koblet til mikroskopet. Prosessen ble gjennomført i tre påfølgende dager for et forsøk og på dag 1, 3 og 6 for et annet forsøk.
Bildene ble i etterkant kvalitativt analysert.
30
2.6 Deteksjon av celledød
Celledød detekteres via en enkel metode som farger døde celler med trypanblåløsning.
Metoden gjør det mulig å observere og telle døde og levende celler ved bruk av
lysmikroskop. Døde celler har penetrerbar cellemembran som gjør at trypanblåløsning kan penetrere gjennom cellemembran og resultere i blåfargede celler. Levende celler har intakt cellemembran som hindrer penetrasjon av trypanblåløsning. Disse cellene forblir derfor ufargede og kan telles (figur 2.2).
Figur 2.2. Deteksjon av celledød i PC12-celler. Døde celler har penetrerbar membran som gjør at trypanblåløsning kan penetrere gjennom cellemembran og farge cellene blåt. Intakt membran hos levende celler hindrer penetrasjon av trypanblåløsningen og cellene forblir ufarget. Svart piler viser døde celler. Hvit piler viser levende celler. Bildet viser døde og levende ueksponerte kontrollceller.
Celler dyrkes i medium skåler (21,5 cm2) og eksponeres etter 24 timer inkubasjon i inkubatorskap ved 37 °C og 5 % CO2. Deteksjon av celledød gjennomføres 48 timer etter eksponering. Lysmikroskop med 40 ganger forstørrelse brukes.
31
2.6.1 Prosedyre for farging med trypanblå
1. 2% trypanblå stockløsning og 1,8% NaCl stockløsning blandes i forhold 1:1 (tabell 2.16). 250 μl trypanblåløsning trenges for hver skål (medium skåler). Nødvendig mengde løsning bestemmes utifra dette.
2. Volumet i skålene (3,3 ml) justeres til 1 ml.
3. 250 μl trypanblåløsning overføres hver skål og skålen beveges forsiktig for å fordele løsningen over hele skålen.
4. Skålene inkuberes i inkubatorskap ved 37 °C og 5 % CO2 i 30 minutter.
5. Trypanblåløsning fjernes helt av skålene. Antall døde celler (blå farget celler) og antall levende celler (ufargede celler) telles under lysmikroskop. Celler i 3 tilfeldig valgte soner i hver skål telles. Andel døde celler av total antall celler beregnes og resultatet gis i prosent.
Tabell 2.16 Løsninger benyttet til deteksjon av celledød
Løsning Komponent Mengde
2% trypanblå stockløsning
Komponentene blandes og varmes opp til kokepunktet under avtrekk. Blandingen avkjøles i romtemperatur og filtreres.
Oppbevares i romtemperatur
1,8% NaCl
Oppbevares i romtemperatur
Trypanblå MQ-vann
NaCl MQ-vann
1 g 50 ml
1,8 g 100 ml
32
2.7 Statistiske analyser
Figurer i resultatet ble tegnet i Microsoft ® Exel for Mac 2011. Resultat er presentert som gjennomsnitt av flere uavhengige forsøk med standardfeil (SE).
Programmet Sigmaplot 13.0 ble benyttet for statistiske analyser. For sammenligning av flere normalfordelte datasett ble One Way Analysis of Variance (ANOVA) benyttet. For
sammenligning av flere ikke normalfordelte datasett ble Kruskal-Wallis ANOVA on Ranks benyttet. T-test ble benyttet for parvis sammenligning av normalfordelte datasett, og Mann- Whitney Rank Sum Test ble benyttet for parvis sammenligning av ikke normalfordelte datasett. P-verdi på < 0.05 ble vurdert som signifikant og er merket på figurene.
33
3 Resultater
3.1 Morfometrisk analyse
Kvalitativ morfometrisk analyse ble gjennomført for å se eventuelle endringer i PC12- cellenes morfologi ved eksponering med SiNP. PC12-cellene ble først eksponert for NGF (Nervevekstfaktor) for å se cellenes respondering til NGF og nevrittutvekst. Cellene responderte til NGF og utviklet lange nevritter (figur 3.1 A). Deretter ble to uavhengige forsøk med NP-er gjennomført. Mikroskopisk analyse av cellene i tre påfølgende dager viste ingen klar forskjell i cellene på dag 1 og 2. Cellene hadde varierende form og en del av dem hadde utviklet nevritter (figur 3.1 B-G). Men derimot på dag 3 var det en forskjell i cellene eksponert for både Si10 og Si50 NP-er sammenlignet med kontrollceller (figur 3.1 H-J). I cellene eksponert for Si10 og Si50 NP-er hadde en del av cellene fått avlang, trådlignende form (figur 3.1 I,J). Ingen av kontrollcellene hadde utviklet denne celle formen på dag 3 (figur 3.1 H).
(A) PC12-celler eksponert for NGF
40
Dag1
(B) Kontroll
(C) Si10
41 (D) Si50
Dag 2
(E) Kontroll
42 (F) Si10
(G) Si50
43
Dag 3
(H) Kontroll
(I) Si10
44 (J) Si50
Figur 3.1. Si10 og Si50 NP-er fører til utvikling av avlange trådlignende PC12-celler.
PC12-celler ble dyrket og inkubert. Etter 24 timer ble cellene eksponert med følgende NP konsentrasjoner: Si10 (25 mg/ml) (C, F, I) og Si50 (50 mg/ml) (D, G, J) og NGF. Cellen ble morfometrisk analysert under mikroskop, 24, 48 og 72 timer etter eksponering. (A) PC12-celler på dag 3 etter eksponering for NGF. Kontroll er ueksponerte celler. To uavhengige forsøk ble
gjennomført. Tre bilder fra 3 synsfelt i kontroll, Si10 og Si50 NP eksponerte celler ble tatt på dag1, 2 og 3. Tre representative bilder fra hver dag er vist her. Svarte piler viser vanlige celler. Hvite piler viser avlange celler som ses i Si10 og Si50 eksponerte PC12 celler 72 timer etter eksponering (I, J).
3.2 Celledød
3.2.1 Celledød ved bruk av batch 1 nanopartikler
Endepunktet celledød ble valgt for å studere i hvilken grad eksponering med Si10 og Si50 NP ville påvirke cellenes overlevelse og om hvilke konsentrasjon som ville gi levende celler under promotoraktivitet studier. Effekt av følgende Si10 NP konsentrasjoner: 12,5 mg/ml, 25
45 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, og følgende Si50 NP konsentrasjoner: 25mg/ml, 50mg/ml, 100mg/ml, 200mg/ml, på PC12-cellers overlevelse ble studert.
Under gjennomføring av disse forsøkene var det behov for en ny batch fortynnet nanopartikkel stamløsning. Både Si10 og Si50 NP fra den nye batchen førte til større
dødelighet i eksponerte celler sammenlignet med Si10 og Si50 NP fra første batch. Resultatet er derfor delt i gjennomsnittlig celledød fra forsøk utført med batch nummer 1 NP og forsøk utført med batch nummer 2 NP. Det er tatt hensyn til dette i promotor aktivitet studier, slik at resultater er delt og sammenlignet.
Resultatet fra forsøk utført med batch 1 viser at Si10 NP i konsentrasjon: 25 mg/ml, 50
mg/ml og 100 mg/ml og Si50 NP i konsentrasjon 50 mg/ml har tendens til å gi høyre celledød sammenlignet med ueksponerte kontrollceller. Maksimum celledød ved bruk av batch 1 NP er 29%, som sess ved Si10 NP (100mg/ml) eksponerte celler (figur 3.2 A). Konsentrasjonen 25 mg/ml av Si10 NP og 50 mg/ml av Si50 NP ble brukt i promotoraktivitet studiene (i forsøk med bare en konsentrasjon av Si10 og Si50).
(A)
Figur 3.2. PC12-celledød utført med batch 1 Si10 og Si50 NP.
PC12-celler ble dyrket og inkubert. Etter 24 timer ble cellene eksponert med følgende NP
konsentrasjoner: Si10 (12,5 mg/ml), Si10 (25 mg/ml), Si10 (50 mg/ml), Si10 (100 mg/ml), Si50 (25 mg/ml), Si50 (50 mg/ml), Si50 (100 mg/ml), Si50 (200 mg/ml). Kontroll er ueksponerte celler. 48 timer etter eksponering ble cellene farget med trypanblå og andel døde celler av totalt antall celler ble talt. Figur (A) Gjennomsnittlig % celledød. n = 5 forsøk med 3 skåler for kontroll, Si10 (25 mg/ml) og Si50 (50 mg/ml) i hvert forsøk. n = 2 forsøk med 3 skåler for Si10 (12,5 mg/ml), Si10 (50 mg/ml), Si50 (25 mg/ml) og Si50 (100 mg/ml) i hvert forsøk. n=1 forsøk med 3 skåler for Si10 (100 mg/ml) og Si50 (200 mg/ml). Resultat er basert på n uavhengige forsøk. Søyler representerer gjennomsnitlig
± SE av alle skålene.
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
40%
45%
50%
Celledød
46
3.2.2 Celledød ved bruk av batch 2 nanopartikler
Resultat fra forsøk utført med batch 2 viser at Si10 NP i følgende konsentrasjoner: 25 mg/ml, 100 mg/ml og Si50 NP i følgende konsentrasjoner: 50 mg/ml, 100 mg/ml har tendens til å gi mye høyre celledød sammenlignet med ueksponerte kontrollceller. SiNP i konsentrasjon (100 mg/ml) gir 100% celledød i eksponerte PC12-celler (figur 3.3 A) .
(A)
Figur 3.3. PC12-celledød utført med batch 2 Si10 og Si50 NP.
PC12-celler ble dyrket og inkubert. Etter 24 timer ble cellene eksponert med følgende nanopartikkel konsentrasjoner: Si10 (25 mg/ml), Si10 (100 mg/ml), Si50 (50 mg/ml), Si50 (100 mg/ml). Kontroll er ueksponerte celler. 48 timer etter eksponering ble cellene farget med trypanblå og andel døde celler av totalt antall celler ble talt. Figur (A) Gjennomsnittlig % celledød (andel døde celler delt på totalt antall celler). n = 3 for kontroll og Si10 (25 mg/ml). n = 2 for Si50 (100 mg/ml). n=1 for Si10 (100 mg/ml), Si50 (50 mg/ml). Resultat er basert på n uavhengige forsøk. Søyler representerer gjennomsnitlig ± SE av alle skålene.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
Kontroll Si10-25 mg/ml
Si10-100 mg/ml
Si50-50 mg/ml
Si50-100 mg/ml
Celledød
47
3.3 Promotoraktivitet studier
3.3.1 GCS-promotoraktivitet i silika nanopartikkel eksponerte PC12-celler
Flere studier antyder at SiNP-er fører til oksidativ stress. I tillegg viser resultatet fra celledød studiet (3.2) at SiNP-er fører til økt celledød i PC12 celler.
Det var derfor interessant å studere effekten av silika NP-er på GCS-promotoraktivitet.
Effekten av Si10 (12,5 mg/ml), (25 mg/ml), (50 mg/ml) og Si50 (25 mg/ml), (50 mg/ml) og (100 mg/ml) NP-er på GCS-promotoraktivitet i PC12-celler ble studert.
Basert på resultatet fra luciferaseaktivitet fører Si10 (12,5 mg/ml) NP til signifikant økning i eksponerte cellers GCS-promotoraktivitet sammenlignet med ueksponerte kontrollceller (figur 3.4 A). Andre studerte konsentrasjoner av både Si10 og Si50 NP-er ga ingen signifikant forskjell i eksponerte cellers GCS-promotoraktivitet sammenlignet med
ueksponerte kontrollceller men viste tendens til økning av promotoraktiviteten (figur 3.4 A- D). GCS-promotoraktivitet studiet ble gjennomført med batch 1 SiNP.
(A) (B)
*
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6
GCS-luc RLU
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Renillakorrigert GCS-luc RLU
48
(C) (D)
Figur 3.4. Si10 (12,5 mg/ml) NP fører til signifikant økt GCS-promotoraktivitet i PC12-celler.
PC12-celler ble dyrket og inkubert i 24 timer. Cellene ble transfektert med GCS-luc plasmid.
Eksponering av cellene ble gjennomført 24 timer etter transfeksjon. Følgende NP konsentrasjoner ble benyttet: Si10 (12,5 mg/ml), Si10 (25 mg/ml), Si10 (50 mg/ml), Si50 (25 mg/ml), Si50 (50 mg/ml) og Si50 (100 mg/ml). Kontroll er ueksponert celler. Ildflueluciferase aktivitet er målt 24 timer etter eksponering. Figur (A) gjennomsnittlig ildflueluciferase aktivitet. *P=0.030 sammenlignet med ueksponert kontroll (Kruskal-Wallis ANOVA on Ranks, Dunn´s method). Figur (B) gjennomsnittlig ildflueluciferase aktivitet korrigert med renillaluciferase aktivitet. Figur (C) gjennomsnittlig
ildflueluciferase aktivitet, av alle 3 NP konsentrasjoner innen hver NP størrelse. Figur (D) gjennomsnittlig ildflueluciferase aktivitet korrigert med renillaluciferase aktivitet, av alle 3 NP konsentrasjoner innen hver NP størrelse. Alle tallene er normalisert til ubehandlet. n = 6 forsøk med 3 skåler for kontroll, Si10 (25 mg/ml) og Si50 (50 mg/ml) i hvert forsøk. n=2 forsøk med 3 skåler for hver konsentrasjon i hvert forsøk. Resultat er basert på n uavhengige forsøk. Søyler representerer gjennomsnitlig ± SE av alle skålene.
3.3.2 Effekt av silika nanopartikler på MMP9-promotoraktivitet i PC12- celler
Resultater fra morfometrisk analyse viste forandring i PC12-celler eksponert for SiNP (3.1 morfometrisk analyse). Det var derfor interessant å studere om SiNP hadde påvirket MMP9- promotoraktiviteten.
For å studere denne effekten ble 6 uavhengige forsøk utført, men et forsøk ble ekskludert fra resultatet på grunn av lave verdier på luciferase aktivitet i forhold til bakgrunnsverdier. 4 av forsøkene ble utført med batch 1 SiNP og et av forsøkene ble utført med batch 2 SiNP.
Resultatet er derfor delt i forsøk utført med batch 1 SiNP (figur 3.5) og forsøk utført med begge batcher (figur 3.6). Effekt av følgende Si10 NP konsentrasjoner: 12,5 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml og følgende Si50 NP konsentrasjoner: 25 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, ble studert. Resultatet utført med batch 1 NP viser ingen signifikant forskjell i MMP9-
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4
Kontroll Si10 Si50
GCS-luc RLU
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Kontroll Si10 Si50 Renillakorrigert GCS-luc RLU
