Tildeling av vigselsrett (forskriften § 2)

44 *Contribuição: caracterização morfológica das gerações espermatogoniais

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Rafael Henrique Nóbrega, Caaj Douwe Greebe, Henk van de Kant, Jan Bogerd, Luiz Renato de França, Rüdiger W. Schulz

Publicado em: PlosONE 5(9) (2010)

e12808.doi:10.1371/journal.pone.0012808

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Figure S2.

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Figure S3.

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85 No nosso entendimento, os resultados obtidos no presente estudo propiciam novos conhecimentos ao cenário da biologia espermatogonial em peixes teleósteos, particularmente no que diz respeito às caracterizações dos diferentes tipos de espermatogônias e do nicho espermatogonial, bem como nos aspectos referentes à padronização das técnicas de transplante de espermatogônias tronco em zebrafish.

Nas últimas décadas, a nomenclatura das espermatogônias em

peixes teleósteos tem sido utilizada de forma inconsistente.

Classicamente, dois tipos de espermatogônias são caracterizadas e descritas em peixes: espermatogônias do tipo A, também consideradas isoladas ou primárias; e espermatogônias do tipo B ou secundárias, que são espermatogônias resultantes da primeira divisão da espermatogônia primária. Esta classificação, além de não mencionar a existência de células tronco, também agrupa distintos tipos espermatogoniais no grupo das espermatogônia do tipo B. Desta forma, propusemos uma nova terminologia espermatogonial, com base no número de células por cisto, utilizando ainda os critérios tradicionalmente empregados para roedores tais como morfologia nuclear, número e disposição de nucléolos, e tipo e padrão de distribuição de cromatina. Assim, as espermatogônias de zebrafish foram classificadas em: Aund* (isolada 3 célula tronco?) Aund

(isolada – célula tronco?) Adiff (237 células por cisto) Bearly (14328

células por cisto) Blate (553208 células por cisto). Embora as

espermatogônias isoladas Aund* e Aund apresentem diferentes morfologias

nucleares, não foi possível demonstrar se Aund* e Aund estão separadas por

divisão mitótica ou se correspondem ao mesmo tipo celular em diferentes fases do ciclo celular. Experimentos que melhor caracterizem as espermatogônias isoladas em zebrafish, seja através de marcadores moleculares, ou mesmo através de técnicas de microarray, poderão futuramente elucidar esta questão. Além disso, o padrão de divisão das espermatogônias isoladas, se simétrico ou assimétrico, também é

88 desconhecido e merece, portanto, ser melhor investigado em peixes teleósteos.

Utilizando zebrafish transgênicos que expressam Gfp sob o promotor do gene específico de célula germinativa, vasa, e sabendo da propriedade das células tronco em reter BrdU (ou outros marcadores de proliferação) por longo período de tempo, o nicho espermatogonial em zebrafish pode também ser caracterizado. Nossos resultados mostraram que, semelhantemente ao nicho espermatogonial em mamíferos, as

células tronco espermatogoniais em zebrafish localizam3se

preferencialmente próximas ou adjacentes ao compartimento intersticial. Neste sentido, nossas observações sugerem que a atividade do nicho espermatogonial nesta espécie de teleósteo depende de fatores externos aos túbulos seminíferos tais como, por exemplo, gonadotropinas (Fsh, Lh) e andrógenos, ou ainda fatores parácrinos possivelmente secretados pelas células de Leydig, peritubulares mióides ou endoteliais, dentre outros tipos celulares. No entanto, assim como em mamíferos, a caracterização exata dos elementos celulares envolvidos neste processo, bem como a

possível interação entre eles na regulação do destino das

espermatogônias tronco, é ainda um grande desafio para os pesquisadores nesta área do conhecimento.

Através das técnicas de transplante de espermatogônias, padronizadas no presente estudo para zebrafish, demonstramos que

frações enriquecidas de espermatogônias Aund* e Aund de doadores

transgênicos vasa::egfp foram capazes de colonizar testículos de receptores selvagens (wild3type) cuja espermatogênese endógena havia sido previamente depletada com busulfan. As células transplantadas nos testículos dos peixes receptores desenvolveram3se em cistos de espermatogônias do tipo B e espermatócitos, 3 semanas após o transplante. Não foi possível observar cistos de espermátides, e tampouco espermatozóides, uma vez que a expressão de vasa diminui com o desenvolvimento das células germinativas. Também demonstramos que espermatogônias Aund* e Aund transplantadas em ovários de zebrafish se

diferenciam em oócitos, sugerindo que o nicho receptor é fundamental para determinar o destino das espermatogônias tronco transplantadas. Assim, através das técnicas de transplante de espermatogônias tronco,

87 demonstramos que as espermatogônias Aund* e Aund possuem plasticidade

e potencial tronco. Pois, além de colonizarem e resgatarem a espermatogênese após o transplante em testículos com espermatogênese endógena depletada, também foram capazes de se diferenciarem em oócitos em ovários, cujas células gametogênicas finais (oócitos) foram naturalmente desovadas.

Entretanto, deve ser salientado que a eficiência do transplante foi de 30%, o que de certa forma limita o emprego desta técnica para se estudar a biologia das espermatogônias tronco, ou mesmo, por exemplo, para gerar animais transgênicos. Meios que otimizem a eficiência da técnica de transplante merecem ser investigados. Uma das alternativas vislumbradas para se melhorar esta eficiência seria utilizar receptores naturalmente inférteis, como, por exemplo, animais híbridos resultantes do cruzamento entre Danio rerio e Danio malabaricus. Pois, ao que parece, o tratamento com busulfan cria um microambiente no testículo receptor que favorece diferenciação ao invés de colonização/auto3 renovação, conforme demonstrado pelo perfil hormonal e gênico citados a seguir.

As análises hormonais e gênicas dos testículos depletados com busulfan antes do transplante nos permitiram ter uma melhor compreensão do comportamento das células transplantadas neste tipo de ambiente testicular. Assim, níveis elevados de andrógenos, associados à diminuição da expressão gênica do amh (hormônio anti3Mülleriano), além de níveis drasticamente elevados de igf3 (igf1b) (fator de crescimento semelhante à insulina 3), sugerem a existência de ambiente (nicho) no animal receptor que favorece a diferenciação espermatogonial, ao invés da auto3renovação. Esta condição de pró3diferenciação do ambiente receptor provavelmente deve ter interferido no comportamento das espermatogônias tronco transplantadas. Neste sentido, estes importantes resultados nos levaram a desenvolver estudos que se encontram em andamento, e que se referem ao efeito biológico de determinados fatores de crescimento recombinante (Amh e Igf3) na regulação do nicho espermatogonial em zebrafish. Nestes estudos, observamos efeito “yin3 yang” destes fatores de crescimento. Pois, enquanto o Amh bloqueia a diferenciação espermatogonial sem promover auto3renovação das

88 espermatogônias tronco, o Igf3, cuja expressão é estimulada por Fsh e andrógenos, estimula a diferenciação e proliferação espermatogonial. Ainda em relação aos peixes receptores que tiveram sua espermatogênese endógena depletada com busulfan, seria interessante investigar o efeito do estradiol nos níveis androgênicos e na expressão do amh e do igf3. Se o tratamento estrogênico minimizar os efeitos de pró3diferenciação observado no ambiente testicular dos peixes receptores, este método poderia ser utilizado como alternativa para se otimizar a colonização/auto3 renovação das espermatogônias tronco após o transplante.

Em síntese, no presente estudo o zebrafish é apresentado como modelo experimental para se investigar a biologia da espermatogônia tronco em peixes teleósteos. Neste sentido, além de avançarmos o

conhecimento sobre a caracterização das células germinativas

espermatogoniais, particularmente acerca das espermatogônias tronco e sua localização (nicho), todas as técnicas necessárias ao transplante de espermatogônias em zebrafish foram padronizadas, permitindo, assim, através da utilização das mesmas, demonstrar funcionalmente o potencial de células tronco destas espermatogônias, tanto nos túbulos seminíferos quanto nos ovários de zebrafish. No entanto, a eficiência das técnicas de transplante, particularmente no que se refere à produção de número viável e contínuo de gametas, necessita ser ainda otimizada. Alternativas para se alcançarem estes objetivos seriam, por exemplo, minimizar os efeitos pró3diferenciação do ambiente testicular do animal receptor. Neste contexto, os resultados obtidos através das análises hormonais e gênicas nos forneceram importantes indícios de como alguns fatores de crescimento regulam o nicho espermatogonial. Estas valiosas informações poderão ser úteis no futuro para se melhor compreender a regulação das espermatogônias tronco em zebrafish, podendo ainda ser estendidas para outras espécies de peixes teleósteos, em especial àquelas de interesse econômico, ou mesmo ameaçadas de extinção. Abordagens visando controlar a puberdade ou expandir o número de espermatogônias tronco

in vitro antes do transplante, com finalidades comerciais ou de

preservação de espécies, bem como geração de peixes transgênicos, também poderão ser implementadas.

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