Durante o primeiro ano de vida da criança, a instalação da microbiota intestinal está sujeita a intervenções de fatores externos, como tipo de parto, alimentação e condições ambientais, além de fatores inerentes ao hospedeiro. Estudos mostram o início da estabilização da microbiota em torno do segundo ano de vida. Após a estabilização a sua composição permanece estável por
toda fase adulta do indivíduo (ROGER; MCCARTNEY, 2010).
Devido à importância do tema e aos poucos estudos brasileiros descritos na literatura é de grande valia o conhecimento da instalação e estabilização da microbiota intestinal. Neste estudo o objetivo foi avaliar o processo de colonização da microbiota bacteriana intestinal durante o primeiro ano de vida em onze crianças.
Para a avaliação da instalação da microbiota intestinal foi utilizada a técnica de PCR-DGGE. Na técnica de PCR-DGGE os fragmentos de mesmo tamanho dos produtos da reação de PCR são separados com base nas diferenças de suas bases. A separação acontece devido à diminuição na mobilidade da dupla fita de DNA parcialmente desnaturada em um gel de
poliacrilamida com um gradiente linear de desnaturação (MUYZER; SMALLA
1998).
O gene 16S rRNA contém regiões altamente conservadas entre as espécies bacterianas e regiões hiper-variáveis (regiões V) que contém as características filogenéticas específicas de grupos e espécies bacterianas (TANNOCK, 2002). Nesse trabalho foi utilizado como alvo a região V3 do gene 16S rRNA por apresentar um padrão com maior número de bandas no gel de
DGGE (YU; MORRISON, 2004).
O processo de colonização do trato gastrointestinal pode ser dividido em diferentes estágios. O estagio inicial ocorre durante o parto e nas primeiras horas de vida. O segundo estágio compreende a fase de amamentação e o terceiro estágio se refere à introdução de alimentos sólidos na dieta da criança
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No início da colonização, a microbiota de crianças amamentadas com fórmulas artificiais se apresenta mais diversa em relação às crianças
amamentadas exclusivamente com leite materno (FAVIER; VOS; AKKEMANS,
2003; ROGER; MCCARTNEY, 2010). Crianças amamentadas exclusivamente
com leite materno tem uma microbiota intestinal com predomínio da colonização por bifidobactérias ao passo que crianças amamentadas com fórmulas artificiais apresentam grande prevalência de enterobactérias (FAVIER et al., 2002).
No presente estudo os resultados mostraram a colonização por bifidobactérias nas amostras iniciais de 2 dias. Foi identificada banda correspondente a bifidobactéria nas amostras de 6 crianças analisadas. Somente em uma criança a banda correspondente a bifidobactéria permaneceu em todas as amostras após seu surgimento, nas outras crianças ocorreu uma flutuação da presença dessa banda. Nas crianças analisadas não foi possível identificar uma padrão de aleitamento. Esses dados vão de encontro a um estudo realizado na Holanda com análise do estabelecimento da microbiota em duas crianças, uma amamentada exclusivamente com leite materno e outra amamentada inicialmente com leite materno e posterior aleitamento com leite formulado, mostrou que os perfis das duas crianças apresentaram colonização por bifidobactérias a partir do terceiro dia de vida. Para a criança amamentada exclusivamente com leite materno a banda correspondente a bifidobactéria no gel de DGGE apareceu no terceiro dia de vida e permaneceu até o desmame da criança. Para a outra criança a introdução de leite formulado provocou um aumento na complexidade da microbiota e após o desmame houve uma flutuação na presença da banda correspondente à bifidobactéria (FAVIER et al, 2002).
Em outro estudo longitudinal de investigação da instalação da microbiota de crianças amamentadas exclusivamente com leite materno em relação à crianças que foram amamentadas por fórmula artificial é observado que antes do desmame a microbiota das crianças amamentadas com fórmulas artificiais é mais diversa em relação às amamentadas com leite materno e após o desmame é observado uma alteração na diversidade da microbiota nos dois
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grupos. As análises das amostras colhidas mensalmente até os 12 meses de idade indicam que as crianças amamentadas com fórmula artificial apresentam
uma maior estabilidade da microbiota (ROGER; MCCARTNEY, 2010).
A introdução de alimentos sólidos na dieta da criança provoca uma
grande mudança na diversidade da microbiota intestinal (FAVIER; VOS;
AKKEMANS, 2003; ROGER; MCCARTNEY, 2010). A composição da dieta recebida pela criança é tida como um fator de muita influencia na diversidade da microbiota intestinal (NIELSEN et al, 2007). Com a introdução de alimentos sólidos é possível observar a alteração do perfil da microbiota, com aumento do número de bandas, fato que é observado na maioria das crianças analisadas (crianças 1, 3, 7, 12, 14, e 15) no presente estudo.
A introdução precoce de alimentos na dieta está associada à instabilidade no estabelecimento da microbiota intestinal o que pode ser observado durante o processo de sua instalação nas crianças 2, 6 e 8. Devido ao fato da alimentação sólida provocar mudanças na microbiota, tornando-a mais complexa, os resultados obtidos mostraram que nas crianças que tiveram a introdução precoce de alimentos sólidos na dieta houve uma grande flutuação de bandas durante o período analisado. Os resultados também mostraram o não compartilhamento de banda comum nas amostras de uma mesma criança.
A utilização de antibióticos bem como a duração de sua administração são fatores que influenciam a colonização primária da microbiota. No presente estudo as crianças 1, 3, 6, 8, 12, 14 e 17 utilizaram antibiótico durante o primeiro ano de vida e foram observadas alterações nos perfis de bandas de suas amostras. No período que segue a utilização do antibiótico é observada uma diminuição no número de bandas no perfil. Após a suspensão do uso do antibiótico observa-se restabelecimento da microbiota observando-se novamente o aumento do número de bandas no perfil. Essas observações vão de acordo com o estudo realizado com quatro crianças no qual o uso de antibiótico foi relacionado com diminuição na diversidade da microbiota
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A criança 15 foi internada por sete vezes ao longo do primeiro ano de vida devido a quadro de epilepsia grave. No sétimo mês a criança 15 foi internada por 2 vezes, a amostra seguinte a esse período, amostra de 8 meses, apresentou uma diminuição no número de bandas no perfil do DGGE. No mês seguinte, 9 meses, foi possível observar a recuperação da microbiota. Embora essa criança tenha tido interferência pela microbiota hospitalar, durante os períodos de internação, os resultados mostraram que o processo global da instalação da sua microbiota intestinal não sofreu alterações em relação a esse fator. Fato que sugere que a influência da microbiota hospitalar provoca alterações temporárias na microbiota, que é mantida por fatores relacionados ao aleitamento, à alimentação e características individuais da criança.
A desnutrição e os cuidados com a criança como os relacionados à higiene e condições sanitárias também influenciam o processo de colonização (KAU et al, 2011). Pode-se observar em algumas crianças estudadas o baixo ganho de peso ao final do primeiro ano de vida. No caso da criança 2, que apresentou uma grande instabilidade no processo de estabelecimento da microbiota, no décimo segundo mês de vida foi relatado no histórico mensal baixo ganho de peso e nas amostras coletada após esse período, amostra de 13 meses, houve uma diminuição do número de bandas no perfil dessa amostra. O histórico mensal da criança 8, que também apresentou colonização instável da microbiota, aponta precárias condições de higiene da mãe no cuidado com a criança e precárias condições de moradia da família, onde cinco pessoas habitam um único cômodo sem janela e com alta umidade. O histórico também aponta que a criança 8 apresentou quatro episódios de diarreia durante o primeiro ano de vida. Esses fatores somados à introdução de alimento sólido precocemente e à fatores individuais podem explicar a instabilidade da colonização inicial da microbiota intestinal nas crianças. Outra criança que também apresentou quadro de desnutrição durante o primeiro ano de vida foi a criança 17. Seu histórico mensal aponta desnutrição no oitavo mês de vida e observa-se uma diminuição de bandas na amostra de 9 meses quando comparada às amostras dos períodos seguintes.
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No início das coletas das amostras foi feita a tentativa de se delimitar um grupo homogêneo de pacientes para sua melhor avaliação, mas foram observados eventos diferentes para cada criança o que impossibilitou o delineamento de grupos. Assim cada criança foi analisada individualmente. Alguns períodos determinados foram analisados em conjunto, mas os hiatos entre as coletas das amostras dificultaram tanto as análises individuais de cada criança quanto as análises por períodos específicos.
Devido a uma amostragem pequena, onze indivíduos, não foi possível a realização da análise estatística de dados quantitativos. Considerando-se os dados qualitativos entre amostras e perfis de bandas foi feita análise estatística para dados qualitativos com a utilização de análise multivariada, no caso desse estudo análises de correspondência.
As intensidades das bandas nos géis podem ser utilizadas para calcular índices de riqueza e diversidade (FROMIN, 2002; ZWIELEHNER et al., 2009), mas é importante destacar que nesse trabalho foram considerados apenas os dados qualitativos de presença e ausência de bandas. As intensidades das bandas não foram consideradas em relação aos índices de diversidade devido às características das amostras, particularidades no processo de extração de
DNA, e viés da reação de PCR (BURR et al., 2006; ARAÚJO; SCHNEIDER,
2008).
Após as análises dos dados do presente estudo foi possível observar que cada criança apresentou um perfil distinto de colonização. No início da colonização verifica-se uma menor quantidade de bandas nas crianças estudadas bem como um menor compartilhamento de bandas entre as crianças. Ao longo do período de estudo foi evidenciada uma sucessão ecológica nas microbiotas analisadas devido ao aumento do número de bandas e maior compartilhamento de bandas comuns entre as crianças. Esses dados corroboram o estudo realizado na Holanda, no qual 14 bebês foram monitorados ao longo do primeiro ano de vida e os resultados mostraram que a composição da microbiota infantil é mais simples que a microbiota de adultos e que é específica para cada uma delas. Apresenta um perfil caótico nos primeiros meses de vida e se torna mais complexa quando se aproxima, ao
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longo do tempo, ao padrão da microbiota de adultos (ZOETENDAL; RAJILIC-
STOJANOVIC, 2011).
A técnica de PCR-DGGE se mostrou uma boa ferramenta para a análise global do desse processo, pois foi possível a análise em um mesmo gel de todas as amostras coletadas de uma mesma criança. O presente estudo mostrou uma relação direta entre a composição da microbiota e os fatores externos relacionados às crianças, como aleitamento, alimentação e uso de medicamentos. Assim, os dados obtidos por PCR-DGGE mostram que os perfis das comunidades bacterianas são indicadores eficazes das alterações externas e individuais de cada criança.
O método apresenta algumas limitações como o próprio viés da reação de PCR quanto a amplificações preferenciais de determinados alvos na sequência de DNA, a não amplificação por deficiência durante a hibridização do oligoiniciador com a sequência alvo e a presença de mais de uma cópia do gene 16S rRNA em algumas espécies bacterianas e a concatenação de bandas durante a separação dos fragmentos por eletroforese sendo necessário o recorte no gel da banda de interesse para clonagem e sequenciamento para
sua identificação (MUYZER; SMALLA, 1998).
As vantagens do método para estudo de comunidades microbianas estão relacionadas ao menor custo da técnica, menos laboriosa e mais rápida em relação à realização de biblioteca genômica, a análise simultânea de várias amostras e a relação direta entre alterações nos perfis e mudanças externas
(MUYZER; SMALLA, 1998).
Embora os resultados observados nesse estudo, conjuntamente com outras análises realizadas em paralelo em nosso grupo de pesquisa, tragam contribuições relevantes ao processo inicial de estabelecimento da microbiota intestinal em um grupo de crianças saudáveis no Brasil, há ainda a necessidade de melhor compreender esse processo devido a grande heterogeneidade da população brasileira.
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