1. INNLEDNING
1.5. Terminologi og symboler
1.5.1. Terminologi
O s p ro to c o lo s e xp e rime nta is utiliza d o s ne ste tra b a lho fo ra m a p ro va d o s p e lo C o mitê d e Étic a e m Pe sq uisa d o Ho sp ita l Sã o Pa ulo / Unive rsid a d e Fe d e ra l d e Sã o Pa ulo , p ro c e sso n°1237/ 00. To d o s o s e sfo rç o s fo ra m fe ito s p a ra minimiza r o so frime nto d o a nima l, d e a c o rd o c o m a Inte rna tio na l Ethic a l G uid e line s (C IO MS/ O MS, 1985).
3.1 – ANIMAIS E G RUPO S DE ESTUDO :
Fo ra m utiliza d a s ra ta s d a ra ç a Wista r a lb ina s a d ulta s p e sa nd o 200- 250g ma ntid a s e m c o nd iç õ e s c o ntro la d a s c o m c ic lo c la ro / e sc uro (12/ 12h), te mp e ra tura d e 21± 2°C , c o m livre a c e sso à á g ua e ra ç ã o p o r to d o o p e río d o d o e xp e rime nto .
O s a nima is fo ra m d ivid id o s c o m re la ç ã o a o s d ife re nte s tra ta me nto s q ue re c e b e ra m:
a ) Anim a is c o ntro le s:
Ra ta s e m d ife re nte s fa se s d o c ic lo e stra l e ra ta s c a stra d a s. Amb o s o s g rup o s re c e b e ra m so luç ã o sa lina e fo ra m d ivid id o s e m:
G RUPO C O NTRO LE 1 - ra ta s e m ESTRO (E) - n=10;
G RUPO C O NTRO LE 2 - ra ta s e m METAESTRO (M) - n=10;
G RUPO C O NTRO LE 3 - ra ta s e m DIESTRO (D) - n=10;
G RUPO C O NTRO LE 5 - ra ta s c a stra d a s. Este g rup o fo i utiliza d o c o mo c o ntro le d a c a stra ç ã o (C X) - n=10;
b) Anim a is e xpe rim e nta is:
To d o s o s a nima is fo ra m sub me tid o s a o mo d e lo d e e p ile p sia ind uzid o p o r p ilo c a rp ina , d e se nvo lve ra m sta tus e p ile p tic us, fa se
sile nc io sa e fo ra m e stud a d o s na fa se c rô nic a .
G RUPO EXPERIMENTAL 1 - ra ta s na fa se e stro q ue re c e b e ra m p ilo c a rp ina 4% (C RO N) - n=10;
G RUPO EXPERIMENTAL 2 - ra ta s c a stra d a s q ue re c e b e ra m p ilo c a rp ina 4%, q ua tro d ia s a p ó s o p ro c e d ime nto c irúrg ic o (C X+C RO N) - n=10;
c ) Anim a is c o m re po siç ã o ho rm o na l
C o m o o b je tivo d e e stud a r a influê nc ia d a te ra p ia d e re p o siç ã o ho rmo na l so b re a fre q üê nc ia d e c rise s e m ra ta s e p ilé p tic a s, o s g rup o s fo ra m d ivid id o s e m:
G RUPO EXPERIMENTAL 3 - ra ta s c a stra d a s q ue re c e b e ra m p ilo c a rp ina 4%, q ua tro d ia s a p ó s o p ro c e d ime nto c irúrg ic o . Ne ste g rup o fo i fe ita re p o siç ã o ho rmo na l d e a c e ta to d e me d ro xip ro g e ste ro na (2 mg / Kg ) p o r via o ra l (C X+C RO N+AMP) - n=10;
G RUPO EXPERIMENTAL 4 - ra ta s c a stra d a s q ue re c e b e ra m p ilo c a rp ina 4%, q ua tro d ia s a p ó s o p ro c e d ime nto c irúrg ic o . Ne ste g rup o fo i fe ita re p o siç ã o ho rmo na l d e 17β-e stra d io l (30 μg / kg ) p o r via o ra l (C X+C RO N+E2) - n=10;
G RUPO EXPERIMENTAL 5 - ra ta s c a stra d a s q ue re c e b e ra m p ilo c a rp ina 4%, q ua tro d ia s a p ó s o p ro c e d ime nto c irúrg ic o . Ne ste g rup o fo i fe ita re p o siç ã o ho rmo na l d e 17β-e stra d io l (30 μg / kg ) + a c e ta to d e me d ro xip ro g e ste ro na (2mg / ml), p o r via o ra l (C X+C RO N+E2+AMP) - n=10;
3.2 - C ASTRAÇ ÃO :
O s a nima is fo ra m a ne ste sia d o s c o m thio ne mb uta l, (50mg / Kg , i.p .). Fo i fe ita tric o to mia no d o rso d o a nima l, se g uid o d e a sse p sia lo c a l c o m p o vid ine tó p ic o e p o ste rio r inc isã o lo ng itud ina l, se g uid a d e p e q ue na s inc isõ e s na musc ula tura d o rsa l, la te ra lme nte . C o m o a uxílio d e uma p inç a , o s o vá rio s fo ra m id e ntific a d o s e re sse c a d o s p o r c a ute riza ç ã o . Ap ó s e ste p ro c e d ime nto , a musc ula tura fo i a p ro xima d a c o m fio c a te g ute simp le s 4-0 e a p e le sutura d a c o m fio d e nylo n 3-0. To d o o ma te ria l utiliza d o p a ra o p ro c e d ime nto c irúrg ic o fo i sub me tid o à e ste riliza ç ã o .
3.3 – ESTUDO C O LPO C ITO LÓ G IC O :
To d o s o s a nima is e stud a d o s ne ste tra b a lho fo ra m sub me tid o s a o e xa me c o lp o c ito ló g ic o p a ra ve rific a ç ã o d a fa se d o c ic lo e stra l. No s a nima is q ue fo ra m c a stra d o s fo i fe ito e xa me c o lp o c ito ló g ic o p a ra ve rific a ç ã o d a fa se d o c ic lo e stra l e p o ste rio r ve rific a ç ã o d e a tro fia g e nita l. O c o nte úd o d o c o nd uto va g ina l fo i o b tid o p o r me io d a intro d uç ã o d e c o nta g o ta s a tra umá tic o c o nte nd o so luç ã o sa lina q ue p o r me io d e suc ç ã o se mistura a o ma te ria l va g ina l a se r e xa mina d o . A so luç ã o a sp ira d a fo i c o lo c a d a so b re lâ mina s d e vid ro e o b se rva d a e m mic ro sc ó p io ó p tic o à fre sc o .
A ve rific a ç ã o d o c ic lo e stra l fo i fe ito d ia ria me nte e a p ó s 3 c ic lo s re g ula re s c o nse c utivo s a s ra ta s fo ra m utiliza d a s.
A a va lia ç ã o d a c a stra ç ã o fo i fe ita no q ua rto d ia a p ó s o p ro c e d ime nto c irúrg ic o , p a ra ve rific a r se a re tira d a d o s o vá rio s fo i e fe tiva . O p a d rã o d e le itura p a ra a tro fia g e nita l (c o nfirma ç ã o d a c a stra ç ã o ) a p re se nta p a d rã o simila r à fa se d ie stro d o c ic lo e stra l, o nd e se p o d e o b se rva r a p re se nç a q ua se q ue e xc lusiva d e le uc ó c ito s.
3.4 – ADMINISTRAÇ ÃO DE PILO C ARPINA:
Fo i a d ministra d a p ilo c a rp ina 4% (PILO , Sig ma , St Lo uis, MILLSTO NE), (350mg / Kg , i.p .) p a ra a ind uç ã o d e sta tus e p ile p tic us. Me tile sc o p o la mina
(Sig ma , 1mg / Kg , s.c ) fo i a d ministra d a 30 minuto s a nte s d a PILO p a ra p re ve nir e fe ito s c o liné rg ic o s p e rifé ric o s. O s a nima is c a stra d o s fo ra m inje ta d o s a p ó s c o nfirma ç ã o d a a tro fia g e nita l e o s nã o c a stra d o s, na fa se e stro d o c ic lo . No s a nima is d o s g rup o s c o ntro le , a PILO fo i sub stituíd a p o r so luç ã o sa lina .
3.5 – O BSERVAÇ ÃO C O NTÍNUA ATRAVÉS DE SISTEMA DE VÍDEO :
Ap ó s a inje ç ã o d e p ilo c a rp ina e a re c up e ra ç ã o d o s a nima is, e le s fo ra m c o lo c a d o s e m g a io la s ind ivid ua is, ma ntid a s e m c o nd iç õ e s c o ntro la d a s c o m c ic lo c la ro / e sc uro (12/ 12h), te mp e ra tura d e 21°C , c o m livre a c e sso à á g ua e c o mid a .
Ap ó s a p rime ira c rise e sp o ntâ ne a , o s a nima is fo ra m o b se rva d o s p o r 30 d ia s. Fo i inic ia d a , a te ra p ia d e re p o siç ã o ho rmo na l e o b se rva ç ã o p o r ma is 30 d ia s. A o b se rva ç ã o fo i re a liza d a p o r 24h/ d ia d e filma g e m e m siste ma d e víd e o -mo nito ra ç ã o "Ste lla te syste m", e m sa la c o m c ic lo c la ro -
e sc uro , se nd o q ue no p e río d o e sc uro , o s a nima is e ra m ma ntid o s so b luz infra ve rme lha , p a ra p o ssib ilita r a visua liza ç ã o d a s c rise s.
3.6 – TERAPIA DE REPO SIÇ ÃO HO RMO NAL:
O s a nima is fo ra m sub me tid o s à te ra p ia d e re p o siç ã o ho rmo na l p o r via o ra l, d ia ria me nte , e ntre a s 10:00 -11:00h d a ma nhã , c o m o a uxílio d e uma a g ulha d e g a va g e m a c o p la d a e m uma se ring a d e p lá stic o d e sc a rtá ve l, q ue fo i intro d uzid a na b o c a d o a nima l a té a ting ir o e stô ma g o , o nd e o c o nte úd o fo i inje ta d o . Esta té c nic a fo i utiliza d a p a ra q ue nã o e xistisse a p o ssib ilid a d e d e va ria ç ã o na d o se d iá ria .
3.7 – ANÁLISE HISTO LÓ G IC A DO S C ÉREBRO S:
Ao té rmino d o p e río d o d e o b se rva ç ã o (60 d ia s), 5/ 10 a nima is d e c a d a g rup o fo ra m p e rfund id o s e o s c é re b ro s re tira d o s p a ra p o ste rio r a ná lise histo ló g ic a a tra vé s d o s mé to d o s d e ne o -Timm e Nissl.
O s a nima is fo ra m a ne ste sia d o s c o m thio ne mb uta l (50 mg / Kg , i.p .) e sa c rific a d o s p o r p e rfusã o tra nsc a rd ía c a . Fo i fe ita uma a b e rtura na c a ixa to rá c ic a d o a nima l p a ra se r p o ssíve l a e xp o siç ã o d o c o ra ç ã o . O ve ntríc ulo e sq ue rd o e ntã o fo i p unc io na d o c o m uma a g ulha e a s so luç õ e s infund id a s fo ra m d re na d a s a tra vé s d e uma se c ç ã o d o á trio d ire ito .
Na p rime ira fa se d a p e rfusã o o s a nima is re c e b e ra m so luç ã o d e sulfe to d e só d io 0.1%, se g uid a p o r so luç ã o fixa d o ra d e g luta ra ld e íd o 3%. To d a s a s so luç õ e s fo ra m p re p a ra d a s e m so luç ã o ta mp o na d a (p H = 7.4). A infusã o fo i fe ita c o m o a uxílio d e uma b o mb a d e p e rfusã o . Em se g uid a , o s c é re b ro s fo ra m re tira d o s d a c a ixa c ra nia na c o m o a uxílio d e uma
g o iva , e c o lo c a d o s e m so luç ã o d e sulfe to d e só d io 0.1%, p o r 6 ho ra s. De c o rrid o e ste p e río d o , fo ra m c o lo c a d o s e m so luç ã o c rio p ro te to ra d e sa c a ro se 30%. O s c é re b ro s fo ra m, e ntã o , c o rta d o s d e fo rma se ria d a e m se c ç õ e s d e 20 e 40 µm d e e sp e ssura e m c rio sta to . Este s c o rte s fo ra m sub me tid o s a e stud o histo ló g ic o p o r d ua s d ife re nte s té c nic a s d e c o lo ra ç ã o , d e sc rita s a se g uir.
3.7.1 – MÉTO DO DE NEO - TIMM:
Esta é uma mo d ific a ç ã o d o tra d ic io na l mé to d o d e Timm (SLO VITER, 1982), q ue inte nsific a a c o lo ra ç ã o e sp e c ífic a d e zinc o , p ro d uzind o me lho r visua liza ç ã o d a s fib ra s musg o sa s, p e rmitind o fá c il o b se rva ç ã o d a re o rg a niza ç ã o siná p tic a .
De p o is q ue o s c o rte s d e 40 µm d e e sp e ssura fo ra m mo nta d o s e m lâ mina s g e la tiniza d a s, p ro c e d e u-se a re ve la ç ã o e m c â ma ra e sc ura , o nd e fo ra m ime rso s e m uma so luç ã o re ve la d o ra à 26ºC . Esta so luç ã o c o nsiste e m 240ml d e g o ma a rá b ic a ; 9,4g d e c itra to d e só d io ; 10,2g d e á c id o c ítric o mo no hid ra ta d o ; 6,8g d e hid ro q uino na e 425mg d e nitra to d e p ra ta , d isso lvid o s e m 165ml d e á g ua d e stila d a .
O s c o rte s a ssim c o ra d o s fo ra m c la ssific a d o s d e a c o rd o c o m a e sc a la sub je tiva utiliza d a p o r Ho lme s e c o ls (1999), q ue a p lic a e sc a la d e 0-V p a ra o b ro ta me nto d e fib ra s musg o sa s sup ra g ra nula re s:
G RAU 0 - a usê nc ia d e g râ nulo s na re g iã o sup ra g ra nula r;
G RAU I – g râ nulo s o c a sio na is e e sp a rso s na re g iã o sup ra g ra nula r d e d istrib uiç ã o ;
G RAU II – Nume ro so s g râ nulo s, d istrib uíd o s d e sc o ntinua me nte na re g iã o sup ra g ra nula r;
G RAU III – G râ nulo s d e d istrib uiç ã o q ua se c o ntínua na re g iã o sup ra g ra nula r;
G RAU IV - De nsa fa ixa d e g râ nulo s d isp o sto s c o ntinua me nte na re g iã o sup ra g ra nula r o u q ua se c o ntínuo s; e
G RAU V - De nsa b a nd a d e g râ nulo s, la mina r e c o ntínua q ue ro d e ia to d a re g iã o sup ra g ra nula r.
3.7.2 – MÉTO DO DE NISSL:
O c re sil vio le ta é um c o ra nte b á sic o utiliza d o p a ra e vid e nc ia r o c ito p la sma d e ne urô nio s. O c ito p la sma c o nté m vá ria s e strutura s, inc lusive o s c o rp úsc ulo s d e Nissl (o u sub stâ nc ia d e Nissl). Esse s c o rp úsc ulo s sã o c o mp o sto s, b a sic a me nte , p o r RNA. Essa c o lo ra ç ã o se rve c o mo ind ic a d o r d a via b ilid a d e ne uro na l p o is, q ua nd o o c o rre uma le sã o ne uro na l, e sse s c o rp úsc ulo s p o d e m d e sa p a re c e r. Esse fe nô me no é c o nhe c id o p o r “ c ro ma tó lise ” .
O s c o rte s d e 20μm fo ra m re c up e ra d o s e m lâ mina s e c o ra d o s c o m c re sil vio le ta (té c nic a d e Nissl), q ue c o nsiste na d e sid ra ta ç ã o d o s c o rte s e m b a nho s suc e ssivo s d e á lc o o l e m c o nc e ntra ç ã o d e c re sc e nte , se g uid a d a ime rsã o e m so luç ã o d e c re sil d e vio le ta (0.5%) d isso lvid a e m so luç ã o d e a c e ta to ta mp o na d o e m p H 3.8. Ime d ia ta me nte a p ó s, o s c o rte s fo ra m d e sid ra ta d o s e m d ife re nte s c o nc e ntra ç õ e s d e á lc o o l, c la rific a d o s c o m xilo l e mo nta d o s c o m la mínula c o m o a uxílio d e e nte lla n.
3.8 – IMUNO HISTO Q UÍMIC A
Ao té rmino d o p e río d o d e o b se rva ç ã o (60 d ia s), 5/ 10 a nima is d e c a d a g rup o fo ra m p e rfund id o s e o s c é re b ro s re tira d o s p a ra p o ste rio r a ná lise histo ló g ic a a tra vé s d a té c nic a d e imuno histo q uímic a .
O s a nima is fo ra m a ne ste sia d o s c o m thio ne mb uta l (50 mg / kg , i.p .) e sa c rific a d o s p o r p e rfusã o tra nsc a rd ía c a . Fo i fe ita uma a b e rtura na c a ixa to rá c ic a d o a nima l p a ra se r p o ssíve l a e xp o siç ã o d o c o ra ç ã o . O ve ntríc ulo e sq ue rd o e ntã o fo i p unc io na d o c o m uma a g ulha e a s so luç õ e s infund id a s fo ra m d re na d a s a tra vé s d e uma se c ç ã o d o á trio d ire ito .
Na p rime ira fa se d a p e rfusã o o s a nima is re c e b e ra m ta mp ã o fo sfa to sa lina (PBS), se g uid a p o r so luç ã o fixa d o ra d e p a ra fo rma ld e íd o 4%. To d a s a s so luç õ e s fo ra m p re p a ra d a s e m so luç ã o ta mp o na d a (p H = 7.4). A infusã o fo i fe ita c o m o a uxílio d e uma b o mb a d e p e rfusã o .
Em se g uid a , o s c é re b ro s fo ra m re tira d o s d a c a ixa c ra nia na c o m o a uxílio d e uma g o iva , e c o lo c a d o s e m so luç ã o d e p a ra fo rma ld e íd o 4%, p o r 6 ho ra s. O s c é re b ro s fo ra m, e ntã o , c o rta d o s d e fo rma se ria d a e m se c ç õ e s d e 50 µm d e e sp e ssura e m vib rá to mo .
A imuno histo q uímic a é uma té c nic a q ue p e rmite lo c a liza r re c e p to re s e p ro te ína s c e lula re s, e p o d e se r re a liza d a d e vá ria s ma ne ira s. Ne ste c a so , fo i utiliza d o o p ro to c o lo p a ra a té c nic a c o m o s c o rte s e m "fre e flo a ting ".
3.8.1 - IMUNO HISTO Q UÍMIC A “fre e flo a ting ”
As fa tia s se le c io na d a s fo ra m la va d a s trê s ve ze s e m PBS. Ap ó s e ste p ro c e d ime nto , a s fa tia s fo ra m e mb e b id a s e m so luç ã o d e p e ró xid o d e hid ro g ê nio 0.1% p o r 10 minuto s p a ra b lo q ue a r a a tivid a d e d a s p e ro xid a se s e nd ó g e na s. Em se g uid a , a s fa tia s fo ra m inc ub a d a s e m so luç ã o d e so ro a lb umina b o vina 10% d ura nte 90 minuto s e ma ntid a s à te mp e ra tura a mb ie nte , p a ra e vita r a lig a ç ã o e ntre o s a ntic o rp o s e a ntíg e no s ine sp e c ífic o s. Ime d ia ta me nte a p ó s e ste p ro c e d ime nto , a s fa tia s fo ra m inc ub a d a s e m so luç ã o d e a ntic o rp o p rimá rio (a nti- p a rva lb umina ) na c o nc e ntra ç ã o d e 1:10 000, c o nte nd o a lb umina b o vina 2%, se nd o ma ntid a s ne sta so luç ã o “ o ve rnig ht” à te mp e ra tura d e 4°C . Po ste rio rme nte , a s fa tia s fo ra m c o lo c a d a s e m so luç ã o c o nte nd o o a ntic o rp o se c und á rio (a nti-mo use Ig G ) p o r um p e río d o d e 90 minuto s, e a se g uir no ABC p o r 90 minuto s.
Pa ra visua liza r a p re se nç a d o a ntic o rp o , a s fa tia s fo ra m re ve la d a s c o m o c ro mó g e no d ia mino b e nzid ina (DAB) 0.06% e m tris HC l 0.05M p H 7.4 e p e ró xid o d e hid ro g ê nio (1
μ
l/ ml). A se g uir, a s fa tia s fo ra m mo nta d a s e m lâ mina s g e la tiniza d a s, d e sid ra ta d a s c o m o uso d e á lc o o l e tílic o a b so luto , d ia finiza d a s c o m xilo l e c o b e rta s c o m la mínula s, a p ó s a c o lo c a ç ã o d e e nte lla n. Ap ó s e ste p ro c e d ime nto , a s lâ mina s fo ra m a na lisa d a s e m mic ro sc ó p io ó p tic o p a ra visua liza ç ã o d a e xp re ssã o d a ma rc a ç ã o .Em to d o s o s e nsa io s, a s fa tia s d o s c é re b ro s d o s a nima is d o s g rup o s e xp e rime nta is, fo ra m p ro c e ssa d a s junta me nte c o m uma fa tia d o a nima l d o g rup o c o ntro le e stro (E). Este p ro c e d ime nto é utiliza d o p a ra p o ste rio r
c o mp a ra ç ã o d o p a d rã o d e ma rc a ç ã o , e vita nd o a ssim q ue se ja fe ita a ná lise ine sp e c ífic a d a imuno ma rc a ç ã o .
3.9 – Q UANTIFIC AÇ ÃO C ELULAR
A q ua ntific a ç ã o c e lula r é um mé to d o p e lo q ua l é p o ssíve l ve rific a r a p e rd a ne uro na l, re sulta d o d e uma le sã o c e re b ra l, e m d ife re nte s té c nic a s histo ló g ic a s.
3.9.1 - Q UANTIFIC AÇ ÃO C ELULAR EM C O RTES C O RADO S C O M A TÉC NIC A
DE NISSL
Se is c o rte s a d ja c e nte s (20 μm) d e c é re b ro s, c o ra d o s c o m a té c nic a d e Nissl fo ra m utiliza d o s, p o r a nima l. Fo ra m a na lisa d a s a s re g iõ e s C A1 e C A3 d o c o rno d e Amo n, d e a mb o s o s hip o c a mp o s, se g uind o a s c o o rd e na d a s e ste re o tá xic a s (-3,3/ -3,8 mm d o Bre g ma ).
A re g iã o C A1 fo i d ivid id a e m trê s p o rç õ e s, d e no mina d a s (a ), (b ) e (c ), e a p o rç ã o (b ) fo i a na lisa d a (FIG URA 1). Na re g iã o C A3, fo i a na lisa d a a p o rç ã o mé d ia . A á re a a na lisa d a e nvo lve 0,5 mm2, o q ue c o rre sp o nd e a o a ume nto d e 10X (FIG URA 2).
FIG URA 1 - Re p re se nta ç ã o e sq ue má tic a d a re g iã o C A1 d o hip o c a mp o q ue fo i d ivid id o e m trê s p o rç õ e s d e no mina d a s C A1a , C A1b e C A1c . Fo i utiliza d a p a ra a q ua ntific a ç ã o c e lula r p e la té c nic a d e Nissl a p o rç ã o C A1b .
FIG URA 2 - Re p re se nta ç ã o e sq ue má tic a d a re g iã o C A3 d o hip o c a mp o o nd e fo i re a liza d a a q ua ntific a ç ã o c e lula r p e la té c nic a d e Nissl.
C A3
C A1a C A1b
3.9.2 - Q UANTIFIC AÇ ÃO C ELULAR EM C O RTES C O RADO S C O M A TÉC NIC A
DE IMUNO HISTO Q UÍMIC A
Se is c o rte s a d ja c e nte s d e c é re b ro s d e e sp e ssura d e 50 μm, imuno ma rc a d o s p a ra p a rva lb umina , fo ra m utiliza d o s p o r a nima l. Fo i a na lisa d a a re g iã o d o g iro d e nta d o d e a mb o s o s hip o c a mp o s, se g uind o a s c o o rd e na d a s e ste re o tá xic a s (-3,3/ -3,8 mm d o Bre g ma ) (FIG URA 3).
To d a s a s c é lula s p re se nte s na s c a ma d a s mo le c ula r, g ra nula r e hila r d o g iro d e nta d o fo ra m c o nsid e ra d a s.
FIG URA 3 - Re p re se nta ç ã o e sq ue má tic a d a re g iã o d o g iro d e nta d o q ue fo i utiliza d a p a ra a q ua ntific a ç ã o d a s c é lula s imuno ma rc a d a s p o r p a rva lb umina . C M - c a ma d a mo le c ula r; C G - c a ma d a g ra nula r e HILO - re g iã o p o limó rfic a d o g iro d e nta d o .
C M Hilo C G
3.10 – Q UANTIFIC AÇ ÃO DE FIBRAS
A q ua ntific a ç ã o d a s fib ra s é um mé to d o p e lo q ua l é p o ssíve l ve rific a r a q ua ntid a d e d e te rmina is G ABAé rg ic o s, ma rc a d o s p e la p a rva lb umina .
Se is c o rte s a d ja c e nte s d e c é re b ro s e m e sp e ssura d e 50μm, imuno ma rc a d o s p a ra p a rva lb umina , fo ra m utiliza d o s p o r a nima l. Fo i a na lisa d o o hilo d o g iro d e nta d o d e a mb o s o s hip o c a mp o s, se g uind o a s c o o rd e na d a s e ste re o tá xic a s (-3,3/ -3,8 mm d o Bre g ma ) (FIG URA 4).
A ima g e m d o g iro d e nta d o fo i c a p tura d a e m um siste ma d e víd e o a c o p la d o a o mic ro sc ó p io d e luz. A ima g e m fo i tra nsfe rid a p a ra o p ro g ra ma d e c o mp uta d o r "Mic ro so ft Fo to Ed ito r", o nd e fo i d e limita d a uma re g iã o d e 2X1c m. Esta ima g e m fo i e ntã o tra nsfe rid a p a ra o utro p ro g ra ma , c ha ma d o "Ima g e To o l" e a c o lo ra ç ã o fo i mud a d a p a ra e sc a la d e c inza p a ra me lho r visua liza ç ã o d a s fib ra s. O limia r d e c o lo ra ç ã o d a s fib ra s fo i a justa d o ma nua lme nte e a na lisa d o p e la d ife re nç a d e inte nsid a d e d e c o lo ra ç ã o . O re sulta d o se d á p e la p o rc e nta g e m d e á re a c o ra d a e m b ra nc o e p re to . Sã o c o nsid e ra d a s a s re g iõ e s e m p re to , q ue c o nté m a s fib ra s. A á re a a na lisa d a e nvo lve 0,5mm2 , o q ue c o rre sp o nd e a o a ume nto d e 10X.
FIG URA 4 - Re p re se nta ç ã o e sq ue má tic a d a re g iã o d o g iro d e nta d o q ue fo i utiliza d a p a ra a q ua ntific a ç ã o d a s fib ra s imuno ma rc a d a s p o r p a rva lb umina .
3.11 - ANÁLISE ESTATÍSTIC A
Pa ra a a ná lise e sta tístic a d e ste tra b a lho , fo i utiliza d o o p ro g ra ma Prisma 3.0.
Na c o mp a ra ç ã o e ntre a fre q üê nc ia d e c rise s fo i utiliza d o o te ste "t" d e Stud e nt. Ta nto p a ra a d e nsid a d e c e lula r p e la té c nic a d e Nissl, a ssim c o mo p e la té c nic a d e imuno histo q uímic a e d e nsid a d e d e fib ra s p e la té c nic a d e imuno histo q uímic a fo i utiliza d o o te ste Ano va d e uma via c o m p ó s te ste d e múltip la c o mp a ra ç ã o d e Tuke y.
C o m o intuito d e fa c ilita r a visua liza ç ã o d o e stud o , a ta b e la 2 a p re se nta d a a se g uir, suma riza o s p ro c e d ime nto s e fe tua d o s e m c a d a g rup o d e e stud o .