2.5.1 Determinação do número de células viáveis nas culturas iniciadoras e nas culturas de Bifidobacterium longum para padronização do inóculo
2.5.1.1 Culturas iniciadoras liofilizadas
Para padronizar a proporção de cada cultura liofilizada para produção das bebidas lácteas foram feitas contagens do número de células viáveis UFC (unidades formadoras de colônias) por grama de liofilizado contido nos sachês conforme Antunes (2004). A contagem inicial foi determinada conforme descrito a seguir: pesagem de 0,1g de cada cultura liofilizada e suspensão em 9,9 mL de água peptonada (0,1%) estéril, repouso por 30 minutos para completa dispersão das células (diluição10-2), seguida de diluições decimais seriadas. Utilizou-se o meio Agar M17 (Difco, USA) adicionado de 0,5% de lactose (p/v) para o cultivo de S. thermophilus (St-TA40) e o Ágar MRS (Acumedia, Lansing, USA) para L. delbrueckii subsp.
bulgaricus LB 340 (Lb 340). As placas foram incubadas a 41ºC por 48 horas, em
microaerofilia.
2.5.1.2 Cultura iniciadora congelada
Para a contagem das células viáveis da cultura congelada de S. thermophilus (St1), essa foi descongelada e ativada em caldo M17 adicionado de 0,5% de lactose (p/v). Para isto, transferiu-se 1mL da cultura para tubo de tampa rosqueável contendo 10 mL do caldo o qual foi incubado em estufa a 41ºC por 24 horas. A cultura ativada foi centrifugada por 15 minutos à 2792g. O sobrenadante foi descartado e a massa
celular foi adicionada a um frasco de tampa rosqueável contendo 100 mL de leite desnatado (12% p/v) (Molico, Nestlé, Brasil) tratado termicamente a 100ºC por 25 minutos. O frasco foi incubado a 41ºC por 12 horas e em seguida, 1mL deste leite fermentado foi adicionado à 9 mL de água peptonada (0,1%) estéril. Em seguida, foram feitas diluições seriadas decimais, empregando-se o mesmo meio e as mesmas condições de incubação descritas para a cultura liofilizada de S. thermophilus (St- TA40).
2.5.1.3 Cultura de Bifidobacterium longum liofilizada
Pesou-se em condições assépticas 0,1g da cultura liofilizada de B. longum BL05 e ressuspendeu em 9,9 mL de água peptonada (0,1%) estéril, repouso por 30 minutos (diluição10-2), seguida de diluições decimais seriadas. Para a contagem das células, utilizou-se o meio MRS adicionado de cisteína (Synth) na concentração de 1 g.L-1. As placas foram incubadas a 37ºC por 72 horas em anaerobiose (Anaerobac, Probac do Brasil).
2.5.1.4 Culturas de Bifidobacterium longum congeladas
Os microtubos (eppendorfs) contendo as culturas congeladas de B. longum (Bl 51A e BL05), foram descongeladas e as culturas ativadas, transferindo-se 1mL da cultura para tubos de tampas rosqueáveis contendo 10 mL de caldo MRS regenerado, mantendo-se headspace mínimo no tubo, conforme Pereira (2012). Em seguida, os tubos foram incubados a 37ºC por 24 horas e após esse período 1mL de cada cultura ativada foi inoculada novamente em 10 mL de caldo MRS e mantidos por mais 24 horas a 37ºC. Logo após, procedeu-se a diluições seriadas decimais empregando-se o mesmo meio e as mesmas condições de incubação descritas para a cultura liofilizada de B. longum (BL05).
2.5.2 Preparo das culturas para obtenção do inóculo
2.5.2.1 Culturas iniciadoras liofilizadas
Pesou-se em condições assépticas, quantidade suficiente do pó da cultura liofilizada de S. thermophilus TA 40 (St-TA40) para obtenção de 3.1010 UFC. Em seguida, adicionou-se a cultura liofilizada em 300 mL de leite desnatado (Molico, Nestlé) reconstituído a 12% (p/v) tratado termicamente a 100ºC por 25 minutos, obtendo-se uma concentração de aproximadamente 108 UFC.mL-1. Esta mistura foi mantida sob agitação durante 20 minutos e, em seguida, distribuída em tubos de ensaio estéreis de tampa rosqueáveis os quais foram congelados a -18ºC até o momento de uso. Para a ativação das células, os tubos foram descongelados e mantidos a 41ºC durante 30 minutos (CHAMPAGNE et al., 2011). Adicionou-se 20 mL desse inóculo à 2,5 L da mistura básica (leite, soro e estabilizante), obtendo-se uma concentração de aproximadamente 106 UFC. mL-1 de células de S. thermophilus,no ínicio da fermentação da bebida láctea.
Para a cultura liofilizada de L. delbrueckii subsp. bulgaricus LB 340 (Lb 340) utilizou-se o mesmo procedimento descrito acima para obtenção de 3.108 UFC e adição da cultura liofilizada em 300 mL de leite. Portanto, obteve-se para o inóculo uma concentração de aproximadamente 106 UFC. mL-1. Foram acrescentados 20 mL desse inóculo a 2,5 L da mistura básica da bebida láctea, obtendo-se uma concentração inicial de L. delbrueckii subsp. bulgaricus de aproximadamente 104 UFC. mL-1
2.5.2.2 Cultura iniciadora congelada
O microtubo contendo a cultura congelada de S. thermophilus St1 foi descongelado e a cultura foi ativada transferindo-se 1mL da mesma para tubo de tampa rosqueável contendo 10 mL de caldo M17 adicionado de 0,5 % de lactose (p/v). O tubo foi incubado a 41ºC por 24 horas. A cultura ativada foi centrifugada por 15 minutos à 2792xg. O sobrenadante foi descartado e a massa celular foi adicionada a um frasco de tampa rosqueável contendo 100 mL de leite desnatado (12% p/v) (Molico, Brasil) tratado termicamente a 100ºC por 25 minutos. O frasco foi incubado a
41ºC por 12 horas. Foram adicionados 20 mL desse inóculo a 2,5 L da mistura básica da bebida. A contagem de S. thermophilus St1 no inóculo foi de aproximadamente 108 UFC. mL-1, atingindo portanto, a concentração inicial de S. thermophilus de aproximadamente 106 UFC. mL-1 na mistura básica.
2.5.2.3 Cultura de Bifidobacterium longum liofilizada
Pesou-se em condições assépticas, quantidade suficiente do pó da cultura liofilizada de B. longum BL05 para obtenção de 1011 UFC. Para isto o sachê foi colocado em temperatura ambiente por um período de 1 hora (CHAMPAGNE et al., 2011) antes da pesagem. Em seguida, adicionou-se a cultura liofilizada em 100 mL de leite esterelizado (12% p/v), obtendo-se uma contagem de 109 UFC. mL-1. Para ativação da bifidobactéria essa mistura foi mantida a 37ºC durante 30 minutos. Foram então, adicionados 10 mL desse inóculo à 200 mL de bebida láctea envasadas em garrafas plásticas, alcançando uma contagem inicial de 108 UFC. mL-1..
2.5.2.4 Culturas de Bifidobacterium longum congeladas
O número de células viáveis das culturas congeladas de Bifidobacterium
longum (Bl 51A e BL05) foi de aproximadamente 108 UFC. mL-1. O mesmo
procedimento foi realizado para o preparo dos inóculos de cada linhagem de B.
longum. A metodologia descrita a seguir foi adaptada de Pereira (2012). Antes de cada
experimento, a cultura foi descongelada e ativada transferindo-se 1mL da cultura para tubos de tampas rosqueáveis contendo 10mL de caldo MRS regenerado e incubado a 37ºC por 24 horas. Para a regeneração do caldo MRS, as tampas dos tubos foram parcialmente desatarraxadas e os tubos imersos (até aproximadamente 80% do seu volume) em água fervente por 10 minutos, seguido do resfriamento até temperatura ambiente. Em seguida, 2mL da cultura ativada foi transferida para tubos de ensaio com tampas rosqueáveis contendo 20mL de caldo MRS regenerado e novamente incubado a 37ºC por 24 horas. Após este período foi feita uma nova transferência de 3mL da cultura ativada para frascos contendo 300 mL de caldo MRS regenerado o qual foi incubado na mesma condição descrita anteriormente. Em todas as transferências, manteve-se headspace mínimo nos tubos. O caldo foi então
centrifugado por 15 minutos a 2792xg. O sobrenadante foi descartado e à massa de células foram adicionados 30mL de solução salina (0,85% p/v) estéril e procedeu-se uma nova centrifugação. Após o descarte do sobrenadante foram adicionados 3 mL de leite desnatado (12% p/v) tratado termicamente obtendo-se o inóculo com uma concentração média de 2.1010 UFC.mL-1 para B. longum 51A e de 6,6.1010 UFC.mL-1 para B. longum BL05.
O inóculo de B. longum 51A ou de BL05 foi adicionado à mistura básica (leite, soro, estabilizante) no início da fermentação, juntamente com a cultura iniciadora ou logo após o término da fermentação. Para a produção das bebidas com adição das culturas de bifidobactérias no início da fermentação, transferiu-se 13 mL do inóculo de
B. longum 51A e 10 mL do inóculo de B. longum BL05 para 2,5 L da mistura básica,
obtendo-se assim uma concentração de aproximadamente 108 UFC.mL-1 para ambas as linhagens de bifidobactérias. Nos tratamentos nos quais as bifidobactérias foram acrescentadas no final da fermentação, 1,0 mL de cada inóculo foi adicionado separadamente à 200 mL de bebida láctea envasada em garrafa plástica, obtendo-se aproximadamente uma contagem de 108 UFC.mL-1 de cada linhagem das bifidobactérias.