4. Resultater og diskusjon
4.2 Tapstall for lam involvert i gaupeklaveprosjekt
Para uma análise refinada dos açúcares capazes de inibir a lectina AFL, foi realizado o teste de inibição com a lectina purificada pela cromatografia de exclusão molecular. Foi utilizada para esse teste a proteína purificada concentrada em Amicon até a concentração de 1 mg.mL-1. Para o teste de inibição foram utilizados os seguintes açúcares: glicose, galactose, manose, lactose, fucose, arabinose, ribose, xilose, N-acetilglicosamina, N- acetilgalactosamina, Ácido neuramínico e KDN (Ácido deaminoneuraminico).
Comparando o resultado de inibição realizado com o muco extraído da Achatina fulica com os resultados de inibição da lectina purificada desse muco da tabela 6, vimos que o padrão da ausência de inibição por N-acelilglicosamina e N-acetilgalactosamina foi mantido, confirmando que se trata de uma nova lectina, diferente das isoladas em outros trabalhos (IGUCHI et al., 1985; MITRA et al., 1988). Foi também observado um aumento da atividade inibitória por lactose e galactose comparando com o resultado da atividade de inibição do muco, devido ao aumento da concentração da proteína purificada em relação ao extrato do muco.
No entanto, o que mais chamou atenção e corrobora com o alto potencial biotecnológico desta lectina é a capacidade de não somente reconhecer ácido siálico, mas também de reconhecer e se ligar de forma diferente a tipos diferentes de ácidos siálicos. Isto
foi provado pelo diferente grau de inibição da AFL em ralação ao Ácido Nacetilneuraminico e ao outro ácido siálico KDN, também chamado de Ácido deaminoneuraminico. A AFL inibiu com MIC de 12,5 mM o Neu5Ac enquanto que mostrou maior interação com o KDN apresentando MIC de 6,25 mM.
Tabela 6 – Resultado da inibição da lectina AFL
Açúcar 100 50 25 12,5 6,25 3,125 1 0.5 Lactose - - - - - - + + KDN - - - - - + + + Neu5Ac - - - - + + + + Ribose - - - - - + + + Galactose - - - - + + + + Arabinose - - - - + + + + Glicose - - - + + + + + Xilose - - - + + + + + Fucose - - + + + + + + Manose - + + + + + + + GlicNAc + + + + + + + + GalNAc + + + + + + + + + = ocorreu aglutinação - = não ocorreu aglutinação
Os ácidos siálicos são α-ceto ácidos formados por uma cadeia de 9 carbonos (ANGATA; VARKI, 2002) e estão envolvidos em processos biológicos como, por exemplo, nas funções de mediadores na adesão célula-célula, mediadores na comunicação intercelular, renovadores celulares, receptores para bactérias e vírus, entre outras (WILSON; VON ITZSTEIN, 2003; SEARS; WONG, 1999).
Estudos mostram que notáveis alterações na estrutura de oligossacarídeos são associadas a doenças humanas, entre elas o câncer (KIM; VARKI, 1997; HAKOMORI, 2002; LAU; DENNIS, 2008). De acordo com Akcay e colaboradores (2001) a superfície das células cancerosas difere em muitos aspectos das células normais. Uma dessas transformações está
associada com mudanças na composição da membrana celular, verificando-se alterações nas membranas em termos do conteúdo de ácido siálico, glicoproteínas e glicolipídeos. Nos processos tumorais o ácido siálico está envolvido na migração, invasão e potencial metastático (CHANG et al., 2006).
Lectinas que se ligam especificamente à ácido siálico são potencialmente úteis na detecção, quantificação, localização, purificação e caracterização de várias biomoléculas que contém ácido siálico. Essas lectinas podem também ser usadas como sondas específicas para determinados derivados de ácido siálico, servindo como marcadores moleculares para fenômenos fisiológicos ou mesmo patológicos (MANDAL; MANDAL, 1990). Ao todo, mais de 100 lectinas já foram purificadas de plantas e de animais e dentre elas muito poucas são as que se ligam e reconhecem especificamente ácido siálico. A maior parte dessas lectinas foi identificada a partir de diversos invertebrados, algumas de hemolinfa, (BIRD, 1974; COHEN, 1984; GOLDSTEIN; PORETZ, 1986; YEATON, 1981a, 1981b) sendo dentre os grupos de invertebrados a maior ocorrência nos grupos de artrópode, molusca e urocordada (YEATON, 1981a). As lectinas ligantes a ácido siálico possuem a característica de necessitarem de íons de cálcio para suas atividades, sendo este também necessário e utilizado durante o processo de purificação. A maioria dessas lectinas possui alto peso molecular e geralmente contém mais de uma subunidade. É comum que essas lectinas se liguem tanto a diferentes derivados de ácidos siálicos como também podem se ligar a outros tipos de açúcares (MANDAL; MANDAL, 1990).
Um dos derivados de ácido siálico é o KDN, uma abreviação de ácido 3-desoxi- D-glicero-a-non-2-ulopiranosônico ou ácido deaminoneuramínico, ou seja, estruturalmente é o ácido neuramínico sem a porção de amina. Historicamente, a primeira ocorrência de KDN foi mostrada em algumas células e secreções de muco de vertebrados inferiores e em algumas espécies de bactérias. A expressão de KDN em glicoconjugados de células e secreções de animais assim como na parede celular de bactérias patogênicas sugere que essa expressão possa estar relacionada a um papel biológico e evolucionário. Essa super expressão de KDN pode refletir a deficiência ou desordem no mecanismo metabólico em células tumorais (INOUE; KITAJIMA, 2006). Estudos mostram a ocorrência de alta expressão de KDN em células vermelhas do cordão umbilical humano e em tumores malignos de ovário e de mama (INOUE et al., 1998). Outro trabalho também relacionado com a presença de KDN em tumores mostra que além da alta presença de Neu5Ac em câncer de pâncreas, existe também uma alta concentração de KDN em câncer de próstata (YABU et al., 2013). Dessa forma, a análise dos carboidratos presentes em células cancerígenas vem sendo amplamente utilizada
como uma ferramenta de grande importância na busca de novos marcadores moleculares tumorais (NARIMATSU et al., 2009; ALLEY et al., 2012).
Os resultados obtidos no presente trabalho mostram a purificação de uma lectina do muco de Achatina fulica, dependente de cálcio, específica a lactose e que reconhece ácido siálico. Para a completa caracterização desta lectina purificada, serão necessários experimentos aprofundados da sequência de aminoácidos desta lectina, para que por homologia de sequência se possa comprovar a qual família de lectinas animais ela pertence ou se suas características podem iniciar um novo grupo de lectinas animais.