4. RESULTATER
4.4.2 Protino ® NiTED
Os materiais e métodos envolvidos neste projeto foram previamente analisados e aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UNIFESP/EPM (Processo no 0044/09), projeto número 533 de 06/02/2009.
3.1) Materiais
A metilbenzidrilamino-resina (MBAR) foi adquirida da Advanced Chemtech e o grau de substituição de 0,7 mmol/g de resina. Os Nα-terc-butiloxicarbonil-aminoácidos (Boc-aa) foram adquiridos da Bachem Inc. e da Advanced Chemtech. Os derivados de aminoácidos com cadeias laterais protegidas utilizados nas sínteses na estratégia t-Boc foram: Cys(MeOBzl); His(Tos); Lys(2-Cl-Z); Ser(Bzl) e Thr(Bzl).
Os ativadores utilizados (BOP, DIC, TBTU, HOBt) foram adquiridos da NovaBiochem.
Nesse trabalho, foram utilizados reagentes e solventes de graus analítico e cromatográfico, das seguintes empresas: Fluka Chemika, Sigma, Mallinckrodt, Merck, Aldrich, Riedel-de haën, Synth, Vetec e Nuclear. Os mesmos não foram submetidos a nenhum tratamento adicional, salvo algumas exceções, cujos procedimentos de purificação estão apresentados a seguir:
- Ácido trifluoroacético (TFA): destilado. - Ácido trifluorometanosulfônico (TFMSA);
- Trietilamina (TEA): refluxada durante uma hora, utilizando anidrido acético (100 mL/L de TEA), para eliminar as aminas primárias e secundárias; em seguida, destilada e tratada com KOH (100 g/L de TEA) sob refluxo, para eliminação de água, sendo novamente destilada e estocada, em frascos âmbar, sob peneira molecular do tipo 4Å, 4-8 mesh, da Aldrich.
- Dimetilformamida (DMF): destilada sob pressão reduzida em presença de ninidrina (1 g/L de DMF) para eliminar aminas livres, e estocada, sob peneira molecular, em frasco âmbar. A análise do teor de aminas contaminantes foi realizada periodicamente, consistindo na formação de uma mistura de DMF, com um volume idêntico de uma solução de dinitrofluorobenzeno (1 mg/mL de etanol 95%), a qual, após 30 minutos de repouso, teve sua absorbância medida a 381 nm, não podendo ultrapassar de 0,15.
- Éter Etílico: tratado com ácido sulfúrico concentrado (50 mL/L de éter), refluxado por 30 minutos, destilado e estocado em frasco âmbar, sobre fio de sódio metálico.
- Piridina: refluxada por 2 horas com KOH (200 g/L de Pyr), destilada e estocada sob peneira molecular 4Å, 4-8 mesh, em frasco âmbar.
A água utilizada nos experimentos foi previamente purificada através de um sistema Mili-Q da Milipore.
3.2) Métodos
3.2.1) Síntese dos peptídeos
A síntese de peptídeos foi realizada pela estratégia química t-Boc. Onde foi empregado como protetor temporário dos Nα–aminogrupos o agrupamento ácido-lábil terc-butiloxicarbonila (t-Boc)(Stewart e Young, 1984), enquanto que para as cadeias laterais foram utilizados protetores derivados do grupo benzila (Bzl)(Kent, 1988).
Foram utilizados nas etapas de acoplamento os seguintes reagentes:
- Benzotriazolil-oxy-tris-(dimetilamino)-fosfônio hexafluorofosfato (BOP) na presença de N,N-Diisopropiletilamina (DIEA)
- N,N-Diisopropilcarbodiimida (DIC) na presença de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) - 2-(1H-Benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio tetrafluoroborato (TBTU) na presença de N,N-Diisopropiletilamina (DIEA)
Em todos eles foram utilizados 2,5 equivalentes de excesso, e o tempo de reação variou de 1 a 2 h. O sistema de solventes utilizado na presença de DIC/HOBt foi uma mistura de 50% de diclorometano (DCM) em dimetilformamida (DMF), enquanto que para BOP/DIEA ou TBTU/DIEA utilizou-se 20% de dimetilsulfóxido (DMSO) em N-Metil-2- pirrolidona (NMP).
No caso de falha na terceira tentativa de acoplamento, os grãos de resina foram acetilados. A acetilação envolveu a reação com 20% de anidrido acético em DMF mais três gotas de piridina (Pyr), por 20 minutos. Cabe salientar, que as porções Nα- e Cα- terminais dos fragmentos apresentam-se acetiladas e amidadas, respectivamente.
3.2.1.1) Estratégia t-Boc
Nesse trabalho foi utilizada a estratégia t-Boc na síntese em fase sólida manual dos peptídeos e, para tanto foi utilizada a resina MBAR como suporte sólido. A estratégia de síntese t-Boc(Merrifield, 1963; Stewart e Young, 1984; Miranda e cols., 1994) consiste, basicamente, em três etapas, esquematizadas na Figura 7:
1- Desproteção: Remoção do grupo protetor t-Boc do Nα-aminogrupo que é realizada pelo tratamento com 50% de ácido trifluoroacético (TFA) em diclorometano (DCM) por 20 minutos.
Figura 7. Representação esquemática da síntese de peptídeos em fase sólida,
2- Neutralização: Devido à desproteção ser feita em meio ácido, tem-se que neutralizar o Nα-aminogrupo que por estar protonado não é um bom nucleófilo. Esta etapa é realizada na presença de 5% de trietilamina (TEA) ou 10% de DIEA em diclorometano.
3- Acoplamento:
Na prática estas três etapas estão descritas no Esquema 1.
Nesta etapa ocorre a formação da ligação peptídica entre o aminoácido que está ancorado à resina com o próximo resíduo de aminoácido que será incorporado à seqüência desejada.
A etapa de acoplamento foi constantemente monitorada através do teste de Kaiser, conhecido também como teste da ninidrina(Kaiser e cols., 1970). Este teste consiste na transferência de uma pequena alíquota da peptídil-resina para um tubo de Duran. Após a adição de 2 gotas de ninidrina (500 mg)/10 ml de etanol, e 1 gota das seguintes soluções: Pyr e Fenol (80 g)/etanol 20 ml, a mistura foi colocada em uma estufa a 110° C, durante 2 a 3 minutos.
O acompanhamento colorimétrico da solução/resina foi feito sempre que se terminava um ciclo de desproteção ou acoplamento. Após a desproteção a coloração azul-intensa foi observada indicando a presença de α-aminogrupos “livres” devido à formação do complexo de Ruheman, como ilustrado na Figura 8. Se fosse observada a mesma coloração após a etapa de acoplamento, procedia-se o reacoplamento.
3.2.1.2) Clivagem e extração dos peptídeos
Para cada 1 g de peptídil-resina, foram utilizados 20 mL da seguinte solução: - 4 mL ácido trifluorometanosulfônico (TFMSA) (20%)
- 14 mL TFA (70%)
- 1 mL dimetilsulfeto (DMS) (5%)
- 1 mL o-cresol (5%)
A peptídil-resina foi tratada pela solução acima sob agitação magnética durante de 16 horas, em um balão de vidro mantido em câmara-fria (em torno de 80C). Em seguida, todo o conteúdo do balão foi transferido para um béquer contendo éter etílico destilado (previamente gelado) e mantido sob agitação magnética durante 20 minutos. A mistura foi transferida para um funil de placa porosa e filtrada a vácuo para a remoção da fase etérea. O material retido na placa porosa do funil foi então solubilizado com uma solução de 5% de ácido acético (AcOH) em H2O. A solução resultante foi então liofilizada.
Esquema 1. Etapas da síntese manual de peptídeos em fase sólida pela estratégia t-Boc. Passos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 I) Etapa de desproteção 2 X MeOH 3 X DCM
1 X 50% TFA em DCM + 0,5 mL de anisol/g de resina (20 minutos)
__________________________________________________
II) Etapa de neutralização
2 X 2% anisol em isopropanol 2 X 5% TEA ou 10% DIEA em DCM 2 X MeOH 2 X 5% TEA ou 10% DIEA em DCM 2 X MeOH 3 X DCM ___________________________________________________________
III) Etapa de acoplamento
2,5 Eq. de Boc-AA + 2.5 Eq. de DIC/HOBt em DCM/DMF (1:1;v/v) [duração 1 a 2 horas]
2 X MeOH
2 X 5% TEA ou 10% DIEA em DCM 2 X MeOH
5 X DCM
Teste de Ninidrina [Negativo ⇒ Passo 2 // Positivo ⇒ passo 17]
Reacoplamento ⇒ 2,5 Eq. Boc-AA + 2,5 TBTU + DIEA (pH 8-9) em DCM/NMP (1:1;v/v) [duração 1 hora]
2 X MeOH
2 X 5% TEA ou 10% DIEA em DCM 2 X MeOH
3 X DCM
Figura 8. Mecanismo da reação de Kaiser para dosagem de Nα-aminogrupo livre. (Kaiser e cols., 1970).
3.2.1.3) Liofilização
A solução obtida após a solubilização do peptideo foi submetida ao processo de liofilização por aproximadamente 18 horas. Após a liofilização os peptídeos brutos foram purificados por cromatografia liquida e novamente liofilizados e pesados.
Foi utilizado o aparelho liofilizador Supermodulo 220 (Savant & Boc Edwards, Mountain Vyew, CA, EUA), acoplado a uma bomba de vácuo modelo VLP 285 (17 m3/h).
3.2.2) Purificação dos peptídeos
As purificações foram feitas, após a liofilização do material bruto, em um sistema de cromatografia preparativo (modelo Delta 600) acoplado a um detector UV-Vis (modelo 2487) e a um coletor de frações (modelo Fraction Collector II) todos da Waters Associates, Milford, MA, EUA) e um registrador (modelo 124) da Servogor, Piscataway, NJ, EUA.
Os solventes utilizados possuíam graus de pureza cromatográficos e a água utilizada foi obtida através de sistema Milli-Q, da Millipore. As condições experimentais foram as seguintes:
Coluna: Júpiter C18 (21,2 x 250 mm), 300 Å, 15 μm
Solventes: A: 0,1% TFA/H2O
B: 0,1% TFA em 60% ACN/H2O
Ou
A: trietilamônio fosfato (TEAP) pH 2,25 em H2O
B: 40% de TEAP pH 2,25 em 60% de ACN Gradiente: 0,33%B / min
Fluxo: 10 mL/min
Comprimento de onda: 220 nm
3.2.3) Caracterização dos peptídeos
3.2.3.1) Cromatografia líquida de fase reversa acoplada a um Espectrômetro de Massas (CL/EM-IES)
Os espectros de massas foram obtidos através de um sistema CL/EM-IES, constituído por um módulo de separação Alliance modelo 2690, um detector do tipo
photodiode array modelo 996, um injetor automático com capacidade para 120 amostras e um detector de massas da Micromass modelo ZMD, todos da Waters Associates (Milford, MA, EUA). O sistema é controlado por uma Workstation Compaq modelo AP200 através
de um software denominado MassLynx, versão 3.5. Os peptídeos foram dissolvidos em água Milli-Q para a concentração final de 2 mg/mL.
As condições experimentais foram: a) Coluna b) : Waters Nova-Pak C18 (2,1 x 150 mm, 60 Å, 3,5 µm). Solventes B: 0,1% TFA em 60% ACN/H2O. : A: 0,1% TFA/H2O. c) Gradiente d) : 5 a 95% de B em 30 min. Fluxo e) : 0,4 mL/min. Comprimento de onda f) : 190-300 nm. Intervalo de massas g) : 200-2000 Da. Modo h) : Electrospray Positivo. Fluxo de nitrogênio i) : 4,1 L/h. Temperatura da fonte j) : 105 ºC. Temperatura de evaporação k) : 400 ºC. Voltagem do “cone” l) : 42 V. Energia no capilar m) : 5 kV. Energia do extrator n) : 8 kV. Energia do multiplicador o) : 860 V.
Resolução de baixo peso molecular p)
: 10,6. Resolução de alto peso molecular: 10,7.
3.2.3.2) Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE – Analítica)
Todos os peptídeos foram caracterizados analiticamente por cromatografia líquida de alta performance (CLAE), em um cromatógrafo liquido composto por duas bombas modelo 515, injetor automático modelo 715, detector UV-VIS modelo 2487, todos da Waters Associates, Milford, MA, EUA, e controlados por uma workstation Compaq através do software Millennium, Versão 3.2.
As condições experimentais foram: a) Coluna b) : Júpiter C18 (4,6 x 150 mm, 300 Å, 5,0 µm). Comprimento de onda c) : 220 nm. Sistemas de solventes B: 0,1% TFA em 60% ACN/H2O. : A: 0,1% TFA/H2O. d) Gradiente e) : 5 a 95% de B em 30 min. Fluxo: 1,5 mL/min.
3.2.4) Análise estrutural de peptídeos – Dicroísmo circular (CD)
A espectroscopia de dicroísmo circular é uma técnica capaz de analisar a estrutura secundária de proteínas e peptídeos em solução. O fenômeno de dicroísmo circular diz respeito à absorção diferenciada da luz circularmente polarizada a direita ou à esquerda. A luz circularmente polarizada é gerada por uma fonte de luz que oscila em duas direções perpendiculares (horizontal e vertical) com a mesma amplitude, mas com diferença de fase (π/2). Com isso, a trajetória do vetor resultante da propagação de luz é helicoidal e conseqüentemente a onda resultante será circularmente polarizada à direita ou à esquerda conforme a diferença de fase for + π/2 ou - π/2 (Vide Figura 9).
Figura 9. Luz circularmente polarizada, característica da técnica de CD.
Polipeptídeos e proteínas possuem certas regiões em que os cromóforos quirais intrínsecos, ou seja, centros assimétricos, apresentam um alto grau de organização devido à presença de α-hélices, folhas-β e outros arranjos. Dependendo da orientação das ligações peptídicas nesses arranjos, as transições ópticas da ligação amida podem se dividir em múltiplas transições (Vide Figura 10).
Desta forma, os comprimentos de onda das transições podem variar, e a intensidade dessas transições pode aumentar ou diminuir. Como conseqüência disso, muitos domínios de estrutura secundária produzem espectros de CD com bandas conhecidas (Vide Figura 11), previamente descritas na literatura (Duysens, 1956). A
intensidade e energia destas transições dependem de Ψ e de Φ, que por sua vez dependem da estrutura secundaria.
Os espectros de CD foram obtidos em um espectropolarímetro Jasco (J810) na faixa de 190-260 nm, utilizando uma cela retangular de quartzo com caminho óptico de 1,0 mm. Os estudos conformacionais dos peptídeos foram feitos em diferentes solventes, tais como, H2O, SDS e TFE. Todos os peptídeos estavam em uma concentração da
ordem de 10-8 M. Os espectros foram coletados com o tempo de resposta de 8 segundos,
velocidade de aquisição 50 nm/min, passo 0,2 nm e em 4 aquisições. O cálculo de elipticidade molar [θ] é dado pela fórmula:
[θ] = θmdeg / 10 . c . l . n
onde, θmdeg = elipticidade medida
c = concentração da amostra (mols/L) l = caminho óptico
n = número de aminoácidos do peptídeo
n → π* em torno de 220 nm π → π* em torno de 190 nm
n → π* dos elétrons do O da carbonila π → π* dos elétrons-π da carbonila
a) UV-CD de -hélice
Positiva (π→π*)perpendicular em 192 nm e negativa (π→π*)paralela em 209 nm Negativa em 222 nm (“red shifted”) (n→π*)
b) UV-CD deβ-sheet
Negativa em 218 nm (π→π*) Positiva em 196 nm (n→π*) c) UV-CD de estrutura randômica Positiva em 212 nm (π→π*) Negativa em 195 nm (n→π*)
Figura 11. Espectros típicos de CD mostrando o perfil característico das estruturas
secundárias
(a) -hélice, (b) β-sheet e (c) estrutura randômica.
(a
(c
(b
Para os estudos em micelas de SDS (Murkeyee e Mysels, 1971), manteve-se fixa a concentração dos peptídeos, em um volume final de 200 µL. Variou-se então a proporção de SDS de 1 a 10 mM. Em relação aos ensaios com TFE, os espectros foram obtidos no intervalo de concentração de 10 e 50%.
3.2.5) Ensaios biológicos
3.2.5.1) Comportamento alimentar de ratos Wistar sob administração (icv)
Os ensaios biológicos para análise do comportamento alimentar foram realizados nos Biotérios do Instituto de Farmacologia e Biologia Molecular (INFAR) e do Departamento de Biofísica, ambos da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP com o auxílio da Dra. Iracema Sena de Andrade e sob a supervisão das Profas. Dras. Eliane Beraldi Ribeiro e Maria Teresa Riggio de Lima Landman.
3.2.5.1.1) Animais
Neste trabalho foram utilizados ratos machos da linhagem Wistar com 12 semanas de idade, pesando entre 250 e 280 g, procedentes do Biotério do Instituto de Farmacologia e Biologia Molecular (INFAR) e do CEDEME, da Universidade Federal de São Paulo.
Os animais foram aclimatados durante uma semana antes dos experimentos em gaiolas coletivas com microisolador, com alimento (ração balanceada com 4% de gordura e 22% de proteína, Purina) e água ad libitum. A sala possuía ciclo de claro/escuro de 12/12 horas (com ciclo de claro a partir das 06h00), temperatura controlada (24 + 1oC) e umidade do ar em torno de 55%.
3.2.5.1.2) Cirurgia para implante de cânula no ventrículo lateral esquerdo
Os animais foram anestesiados por via intraperitoneal (ip) com uma solução de Ketamina/Xilazina (66,6 e 13,3 mg/Kg, respectivamente) e em seguida foram submetidos à tricotomia dos pêlos da cabeça aparados com o auxílio de tesoura metálica. Após a verificação dos sinais vitais e a certificação de que os animais encontravam-se sob indução anestésica, os mesmos foram posicionados no aparelho estereotáxico e submetidos ao procedimento cirúrgico, conforme as sequências fotográficas da Figura 12 para a implantação da cânula guia no ventrículo lateral esquerdo (Figuras 13 e 14), cujos procedimentos são descritos a seguir:
Figura 12. Seqüência fotográfica da cirurgia para a implante da cânula-guia. Foto1 Foto 2 Foto 4 Foto 3 Foto 5 Foto 6 Foto 8 Foto 7
Figura 13. Representação do ventrículo lateral visualizado em um corte do encéfalo
de rato a -1,30 mm do Bregma, adaptado de Paxinos e Watson. Em azul está destacado a cânula guia e em vermelho o ventrículo lateral.
Figura 14. Representação do ventrículo lateral esquerdo
visualizado em um corte do encéfalo de rato a 1,40 mm do Bregma, adaptado de Paxinos e Watson. Em azul está destacado a cânula guia e em vermelho o ventrículo lateral.
Em tempo, avaliou-se ainda a resposta dos animais ao procedimento cirúrgico, através do monitoramento diário de seus pesos e do consumo alimentar durante todo o período de recuperação. Os dados obtidos para cada animal foram então comparados com seu peso individual inicial e também com a sua média de consumo alimentar antes do procedimento cirúrgico. Após o sétimo dia de observação os animais que apresentaram perdas >20% em relação ao seu peso corpóreo inicial foram excluídos desse estudo.
3.2.5.1.3) Cuidados pós-operatórios
Após a implantação da cânula guia no ventrículo lateral esquerdo, os animais foram retirados do aparelho estereotáxico, acondicionados individualmente em gaiola com microisolador e receberam injeções de 100 mg do antibiótico Ceftriaxona Sódica, por via intraperitoneal. Após três horas do procedimento cirúrgico os animais receberam Ibuprofeno por via oral (dose 15 mg/Kg). As doses de Ibuprofeno foram repetidas a cada período de 24 h, até o quarto dia após a intervenção cirúrgica.
No período de recuperação cirúrgica os animais tiveram livre acesso a água e alimento (ração balanceada com 4% de gordura e 22% de proteína, Purina). O ambiente foi mantido sob um ciclo de luz controlado (claro das 6 às 18 h e escuro no período complementar), a temperatura constante (24 ± 1°C) e umidade do ar em torno de 55%.
O período de recuperação cirúrgica foi de sete dias e o posicionamento correto da cânula guia no ventrículo lateral esquerdo foi verificado através da resposta dipsogênica induzida pela angiotensina II(Telles e cols., 2003; Martins e cols., 2009). Uma agulha de injeção (27G de 1,7 mm de comprimento) foi introduzida através da cânula guia e administrou-se uma solução de angiotensina II (20 ng/µ L), observando-se a ingestão imediata de água. O posicionamento da cânula foi considerado correto quando o animal iniciava a ingestão de água após receber a injeção de até 5 µ L da solução. Os animais que não consumiram água após este teste foram utilizados normalmente. Neste caso, após o término das administrações dos peptídeos e dos controles, uma solução de Azul de Evans, via icv, foi injetada nos animais, que foram então decapitados e tiveram os seus cérebros retirados e examinados para localização topográfica da cânula guia. Após a dissecção cerebral, se o ventrículo lateral esquerdo estivesse tingido de azul era o sinal de que a cânula estava corretamente posicionada, e consequentemente os resultados foram considerados válidos. Caso contrário, os dados obtidos para o referido animal eram descartados.
Em tempo, avaliou-se ainda a resposta dos animais ao procedimento cirúrgico, através do monitoramento diário de seus peso e de consumo alimentar, durante todo o período de recuperação. Os dados obtidos para cada animal foram então comparados com seu peso inicial e também com a sua média de consumo alimentar, antes do procedimento cirúrgico. Após o sétimo dia de observação os animais que apresentaram perda >20% do seu peso corporal inicial (antes da intervenção cirúrgica) foram excluídos desse estudo.
3.2.5.1.4) Controle fisiológico e administração dos peptídeos
Passado o período de recuperação cirúrgica e após a injeção de angiotensina II para confirmação do posicionamento da cânula guia, os animais foram agrupados conforme Tabela III e receberam tratamento com injeções icv de fragmentos leptina ou de CSF por um período de quatro dias.
Tabela III. Grupos experimentais tratados com injeções icv de CSF e fragmentos de
leptina.
Grupo Substância injetada (icv)
Lep0 Líquido Cerebrospinal (CSF)
Lep1 Ac-[Ser96]-hLEP89-98-NH2
Lep2 Ac-[Ser96, D-Leu98]-hLEP89-98-NH2 Lep3 Ac-[Ser96, D-His97]-hLEP89-98-NH2
Lep4 Ac-[D-Ser96]-hLEP89-98-NH2
Lep5 Ac-[D-Ser95, Ser96]-hLEP89-98-NH2 Lep6 Ac-[Ser96, D-Lys94]-hLEP89-98-NH2 Lep7 Ac-[Ser96, D-Ser93]-hLEP89-98-NH2 Lep8 Ac-[Ser96, D-Phe92]-hLEP89-98-NH2 Lep9 Ac-[D-Ser96, D-Ala91]-hLEP89-98-NH2 Lep10 Ac-[Ser96, D-Leu90]-hLEP89-98-NH2 Lep11 Ac-[Ser96, D-Val89]-hLEP89-98-NH2
Lep12 [D-Leu
Diariamente foi injetado 1 µg de peptídeo suspenso em 5 µL de CSF no horário compreendido entre 17h00 e 18h00, diretamente no ventrículo lateral esquerdo, através de uma agulha de injeção (27G de 1,8 mm de comprimento). Os peptídeos Ac-hLEP89-98-
NH2(Martins e cols., 2009) e [D-Leu4]-OB3(Grasso e cols., 2001; Novakovic e cols., 2010)
foram utilizados como controles positivos. Como controle negativo utilizou-se injeções de 5 µL de CSF, nas mesmas condições.
A ingestão alimentar e a massa corporal de cada animal foram medidas 24 horas após as injeções icv. Ao término do experimento, os animais foram sacrificados por deslocamento da coluna cervical.
3.2.5.2) Análise da Glicemia
As glicemias dos animais foram medidas no Laboratório de Termometabologia da UNIFESP, sob supervisão da Profa. Dra. Guiomar Nascimento Gomes.
A avaliação glicêmica dos animais foi realizada em diferentes fases do experimento: antes da realização da cirurgia para implantação da cânula no ventrículo lateral esquerdo, após o período de recuperação cirúrgica (sete dias) e 12 horas após o quarto dia tratamento com injeções icv dos fragmentos de leptina ou de CSF. Todas as glicemias foram medidas após um jejum de oito horas.
A flebotomia foi realizada através de uma pequena incisão na extremidade caudal previamente limpa com álcool 70%, com o auxílio de uma lanceta estéril.
Para a dosagem da glicemia foi um aparelho Accu-Check AdvancedII (Roche Diagnostics GMBH, limite de detecção entre 10 e 600 mg/dL, sensibilidade > 96% e acurácia de 98%). Todas as medidas foram feitas em duplicata e o resultado final foi expresso como sendo a média das medidas efetuadas. Uma terceira medida foi efetuada quando houve casos de valores discordantes, com diferenças acima de 10% entre uma e outra medida, sendo consideradas válidas as duas medidas com valores mais próximos.
3.2.5.3) Análise Estatística
Foi feita pelo teste “t” de Student para dados não pareados. O nível de significância adotado foi p < 0,05.
3.2.6) Estudo da estabilidade dos peptídeos em plasma
Para esse estudo foi utilizado plasma heparinizado de ratos Wistar machos, obtidos do CEDEME-UNIFESP. Foi preparada uma solução a 25% de um pool de dez plasmas
em água Milli-Q® que em seguida foi aliquotada em frascos eppendorf® de 1 mL e armazenados em freezer até o momento de uso.
Para a execução do ensaio foram adicionados 20 µL da solução de peptídeo (80 mM) a cada eppendorf® contendo 1 mL de solução de 25% de plasma em água Milli-Q® e incubados em banho-maria a 37ºC, sendo coletadas alíquotas de 100 µL nos intervalos de 0, 10, 30, 60 e 120 minutos. Aos 100 µL coletados foram adicionados cerca de 10 µL de TFA, sendo essa solução mantida a 5ºC por 10 minutos. Em seguida a solução foi centrifugada por 10 minutos a 1.500 r.p.m. de acordo com o protocolo proposto por Powell e colaboradores98. A cinética de degradação foi acompanhada por LC/ESI-MS, injetando-
se 30 µL do sobrenadante em duplicata. O percentual de peptídeo remanescente durante a cinética de degradação foi calculado através da integração da área do pico