Este ensaio consistiu em avaliar a infectividade de M. enterolobii inoculado em plantas de feijão-caupi cv. Pitiúba irrigadas com solução salina ao nível de 100 mM de NaCl durante 18 dias. A cultivar ‘Pitiuba’ foi escolhida por apresentar considerável tolerância à salinidade enquanto que M. enterolobii foi selecionada no ensaio por ser uma espécie considerada mais agressiva que as demais.
Os tratamentos foram: 1) plantas sem inóculo irrigadas com água dessalinizada (controle absoluto); 2) plantas sem inóculo irrigadas com solução 100 mM de NaCl; 3) plantas com inóculo irrigadas com água dessalinizada; 4) plantas com inóculo irrigadas com solução 100 mM de NaCl, as quais foram examinadas em dois períodos, 15 e 18 dias. O ensaio foi conduzido no delineamento inteiramente casualizado, resultando em 8 tratamentos com 8 repetições.
Foram utilizados vasos com capacidade de 1,5 L, contendo areia de rio lavada cinco vezes, a fim de remover sais e argila presentes, e autoclavada a 120ºC durante 50 minutos. As sementes de ‘Pitiúba’ pertenciam ao mesmo lote e foram obtidas junto ao Banco de Germoplasma da UFC. A semeadura seguiu os mesmos padrões empregados no ensaio I. Os vasos foram dispostos sobre outros como suporte para evitar contato direto com abancada (Figura 6).
Figura 6 – Feijão-caupi ‘Pitiúba’ cultivado em vasos com areia.
Fonte: Autor, 2018.
A água dessalinizada para a execução dos tratamentos controle e para o preparo da solução 100 mM de NaCl foi obtida através do dessalinizador modelo WW2, da marca Ferran ®, pertencente ao Departamento de Bioquímica e Fisiologia Molecular da UFC (Laboratório de Fisiologia Vegetal). A massa de NaCl para atingir a molaridade da solução salina requerida neste ensaio foi determinada pela mesma equação descrita no ensaio II. A irrigação neste ensaio foi realizada individual e diariamente em cada vaso, mantendo-se a umidade do solo no
nível da capacidade de campo (CC), por meio do método de pesagem dos vasos (Figura 7) repondo-se a respectiva solução salina sempre que havia redução da água disponível (Figura 8). O volume de água ou de solução salina empregado nos 4 tratamentos para manutenção da CC variou de 72 a 109 mL por vaso.
Figura 7 - Pesagem de vasos para determinação da capacidade de campo em vaso.
Fonte: Autor, 2018.
Figura 8 - Reposição de solução salina para atingir a capacidade de campo em vaso.
Fonte: Autor, 2018.
Aos 10 DAS, as plantas referentes aos tratamentos 2 e 4 passaram a ser irrigadas com solução 100 mM NaCl. Aos 12 DAS realizou-se a inoculação de 5.000 ovos/J2 de M. enterolobii nas plantas referentes aos tratamentos 3 e 4, conforme metodologia descrita no ensaio I.
Parte das plantas dos 4 tratamentos foi retirada aos 15 DAI (17 dias de irrigação com solução salina) e o restante das plantas após 18 DAI (20 dias de irrigação com solução salina). A diferença nas datas de avaliação decorreu do aspecto clorótico apresentado pelas plantas que se acentuou aos 18 dias, sendo com isso, encerrado o ensaio com análise da parte aérea e da raiz de todas as plantas.
As plantas foram removidas cuidadosamente e levadas ao laboratório para determinação das mesmas variáveis agronômicas descritas para o ensaio I (APA, MSFA, MSPA, CR, MFR). Avaliaram-se também o número de galhas (NG) e os estádios de desenvolvimento do nematoide que se encontravam presentes nas raízes.
Para melhor identificação das fases dos nematoides no interior das raízes de cada planta, foi utilizada o método de coloração de nematoides em raiz com fucsina ácida desenvolvido em 1983 por Byrd, Kikpatrick e Barker (FREITAS, NEVES e OLIVEIRA, 2007).
As raízes previamente lavadas foram imersas em um béquer de 200 mL contendo 80 mL de solução à base hipoclorito de sódio (50 mL de água e 30 mL de hipoclorito de sódio comercial). O béquer foi colocado sobre um aquecedor e agitador magnético modelo MA085, da Marconi ®, com a constante agitação da solução com barra magnética durante 6 minutos. Passada esta etapa, o sistema radicular foi retirado e lavado em água corrente para a remoção do hipoclorito de sódio e levado a um béquer de 200 mL contendo água, onde a raiz clarificada permaneceu imersa por 15 minutos.
Em seguida, as raízes foram levadas a um béquer de 100 mL contendo uma solução corante à base de fucsina ácida (30 mL de água e 1 mL de fucsina ácida), a mesma empregada na coloração de massa de ovos (ensaio I), sob aquecimento até fervura (Figura 9). Cerca de 90 segundos após a fervura, as raízes foram retiradas do corante e alocadas em uma peneira, a fim de remover o excesso de solução corante à temperatura ambiente.
Figura 9 - Raízes de feijão-caupi ‘Pitiúba’ coradas com fucsina ácida sob aquecimento.
Após serem lavadas novamente em água corrente, as raízes foram postas em um béquer de 100 mL contendo 30 mL de glicerina e 200 µL de ácido clorídrico, colocado sobre o mesmo aquecedor até atingir entre 70ºC e 80ºC. Por último, as raízes foram removidas da glicerina e, após o total resfriamento das raízes à temperatura ambiente, cortadas em porções de 1 a 2 cm, com auxílio de bisturi. As secções das raízes foram distribuídas entre 11 e 24 lâminas (Figuras 10 e 11), conforme seu tamanho e considerando as regiões da extremidade, centro ou base da raiz. Em seguida, as raízes foram pressionadas com lamínula, para observação e registro das fases do nematoide presentes sob microscópio óptico.
Figura 10 - Conjunto de lâminas de raízes coradas obtidas de plantas inoculadas com Meloidogyne enterolobii e irrigadas com água dessalinizada.
Fonte: Autor, 2018.
Figura 11 - Conjunto de lâminas de raízes coradas obtidas de plantas inoculadas com Meloidogyne enterolobii irrigadas em solução salina.
Fonte: Autor, 2018.
As alterações realizadas ao método original de coloração de nematoide no sistema radicular foram: 1) a agitação contínua da raiz na clarificação, e não a ocasional; 2) a duração do tempo de fervura no corante, que fora aumentado de 30 para 90 segundos, e finalmente 3) a retirada das raízes coradas antes da fervura da glicerina, adotado no método original, para evitar a desintegração das raízes. Estas mudanças possibilitaram obter uma boa intensidade de coloração dos nematoides e firmeza das raízes.