Miljø og fiskeri 46
PRESENTASJON AV INTERVJUA
Ao se avaliar os espécimes dos grupos C10 e q10 submetidos às diferentes técnicas, verificaram-se diferenças importantes entre os mesmos. Assim, muito embora com a técnica da NADH-d os neurônios de diferentes tamanhos tenham sido evidenciados em ambos os grupos (c10, q10), a diferença de intensidade foi uma constante preferencialmente no que se refere aos neurônios pequenos que apresentaram uma menor intensidade no grupo experimental (q10) (Figura 6).
Na reação à NADPH-d chamou a atenção o fato de diversos neurônios do grupo experimental apresentarem um contorno crenado de seu citoplasma, o que muito raramente foi observado nos neurônios do grupo controle (Figura 7).
Relativamente à reação da AChE foi nítida a maior quantidade de neurônios de diferentes tamanhos reativos nos gânglios dos animais do grupo controle (c10). Nos animais queimados (q10) aparentemente foram os neurônios de tamanho pequeno que se mostraram intensamente reativos, o que se comprova com a Figura 8, onde os contornos dos neurônios médios e grandes não reativos podem ser bem observados.
As técnicas imunohistoquímicas para o VIP e a SP analisadas conjuntamente permitiram verificar que nos gânglios dos animais c10 a imunorreatividade foi muito expressiva, contrastando sobremaneira com aquela dos animais queimados (q10). Nestes foi possível verificar uma densidade muito menor de varicosidades relativas ao VIP e à SP. (Figura 9 e 10).
Relativamente à mucosa do estômago verificou-se sob microscopia eletrônica de varredura um aumento aparente da sua espessura nos animais do grupo q10; estruturalmente, não foram notadas diferenças significativas entre o grupo controle e o grupo experimental.(Figura 11). Isto foi confirmado com a mensuração da mucosa em imagens obtidas de lâminas coradas pela técnica HE.(Figuras 11 e 15)
Os gânglios são envoltos por tecido conjuntivo rico em fibras colágenas e escassas fibras elásticas, desta forma, a técnica histológica para evidenciação de colágeno foi a de picro sírius, que analisada sobre microscópio com luz polarizada, observou-se um aumento do colágeno do tipo 3 no gânglio mioentérico do grupo q10 (Figura 12). Na mucosa gástrica, resultado parecido foi observado, onde pode-se constatar um aumento de fibras apresentando maior quantidade de colágeno tipo 3 no grupo q10 (Figura 13). Para a observação de tecido elástico no plexo mioentérico foi utilizada a técnica de Verhoeff, onde apresentou um discreto aumento no grupo q10 (Figura 14).
Figura 6. Fotomicrografias de preparados de membrana do estômago de rato dos grupos c10 (A, C, E) e q 10 (B, D, F) evidenciando gânglios com neurônios mioentéricos NADH-d positivos. Setas indicam diferença de intensidade apresentada pelos grupos estudados. Estrela indica no gânglio o número maior de neurônios grandes no grupo c10 e neurônios menores no grupo q10.
Figura 7. Fotomicrografias de preparados de membrana do estômago de rato dos grupos c10 (A, C, E) e q 10 (B, D, F) evidenciando gânglios com neurônios mioentéricos NADPH-d positivos. Setas indicam contorno regular citoplasmático nos neurônios do grupo c10 e contorno irregular no grupo q10. Estrelas indicam gânglio com maior número de neurônios marcados no grupo q10.
Figura 8. Fotomicrografias de preparados de membrana do estômago de rato dos grupos c10 (A, C, E) e q 10 (B, D, F) evidenciando gânglios com neurônios mioentéricos AChE-r. Setas indicam contorno regular citoplasmático nos neurônios do grupo c10 e contorno irregular no grupo q10. Estrela indica no grupo q10, apenas neurônios pequenos apresentando reatividade ao marcador neuronal.
Figura 9. Demonstra gânglio com neurônios imunorreativos ao VIP. A - grupo c10, B – grupo q10; Setas indicam varicosidades maiores e mais fortemente reativas em A do que em B.
Figura 10. Demonstra gânglio com neurônios imunorreativos a SP. A – grupo c10, B - grupo q10; Setas indicam varicosidades gânglio com imunoreatividade em A, enquanto que em B a imunoreatividade é muito baixa.
Figura 11. Fotomicrografia da mucosa gástrica evidenciada pela técnica de Microscopia Eletrônica de Varredura, (A; C; E) evidenciam mucosa gástrica de animais pertencentes ao grupo c10 e (B; D; F) evidenciação da mucosa de animais do grupo q10.
A
B
D
C
Figura 12. Demonstra o gânglio mioentérico evidenciado pela técnica histológica de picro- sirius e sobre luz polarizada. As setas indicam o gânglio com contorno de fibras colágenas. A – grupo c10 e B – grupo q10. No grupo q10 houve aumento de fibras colágenas ao redor do gânglio.
A
Figura 13. Demonstra a mucosa gástrica evidenciada pela técnica histológica de picro-sirius sobre luz polarizada A - grupo c10 e B - grupo q10. As setas indicam fibras colágenas de maior espessura em B.
A
Figura 14. Demonstra o gânglio mioentérico evidenciado pela técnica histológica de verhoeff. As setas indicam o gânglio com pequena quantidade de fibras elásticas
A - grupo c10 e B - grupo q10. No grupo q10 houve aumento de fibras elásticas
no gânglio.
A
Figura 15. Demonstra o gânglio mioentérico evidenciado pela técnica histológica de hematoxilina-eosina (HE). As setas indicam a espessura da mucosa gástrica. A – grupo c10 e B – grupo q10. No grupo q10 houve aumento da espessura da mucosa.
A
O modelo para que realizasse a LTC no animal, foi o mesmo empregado por Walker e Mason (1986), após a anestesia e tricotomia houvesse a lesão em água à 85°C, de aproximadamente 30% do corpo do animal, isto com base no peso corporal. Fez-se a tricotomia devida à necessidade de expor a área a ser queimada, para que a LTC fosse significativa, pois devido à presença de pêlos a água não alcançaria a pele.
Devido a LTC pode-se observar que no grupo q10, houve perda significante de peso corporal com pequena recuperação posterior, já no grupo c10 a diminuição do peso foi observado, isto devido ao estresse da anestesia e tricotomia, com posterior restabelecimento do peso, bem como ganho da massa corpórea. Com esses resultados pode-se crer que o emprego do modelo da LTC demonstrou efeitos diretos no trato gastrintestinal.
De acordo com Irwin (1931), os neurônios mioentéricos na túnica muscular do trato gastrintestinal encontram-se agrupados em gânglios que se unem por meio das fibras nervosas, formando uma malha ou uma rede ganglionar. Disposição neural semelhante foi também observada nos preparados de membrana do estômago dos dois grupos analisados neste estudo.
Para verificar os efeitos da LTC sobre os neurônios mioentéricos NADH-dr, que permite evidenciar 80% da população total de neurônios no plexo mioentérico, conforme descrito por Young et al.(1993) e NADPH-dr, que evidencia neurônios potencialmente nitrérgicos, ou seja, que sintetizam NO realizou-se a quantificação desses neurônios, bem como a mensuração do perfil celular de 50 neurônios mioentéricos NADH-dr e NADPH-dr por preparado de membrana perfazendo um total de 250 neurônios por grupo (c10 e q10) e por técnica histoquímica empregada.
Pesquisas anteriores indicaram que o número e o tamanho dos neurônios diferem significativamente entre as regiões aglandular e glandular do estômago de ratos. Sendo assim, no presente trabalho foi estudado somente a região glandular, devido a apresentar um revestimento interno mucoso espesso diferente da região aglandular, que internamente apresenta uma delgada membrana serosa e não apresenta glândulas.
A análise quantitativa de neurônios NADH-dr na totalidade da região glandular, demonstrou uma diferença na quantidade neuronal em diferentes regiões (OLIVEIRA et al., 2000; FREGONESI et al., 2001). Porém neste trabalho foi feita uma análise generalizada, sem dividir a pate estudada em regiões, desta maneira,
ocorreu um aumento de 25% (p<0,001) no número de neurônios NADH-dr no grupo q10, comparado ao c10.
Estes resultados concordam com pesquisas feitas em outros modelos experimentais, como as vistas por Natali (1993) e Brandão (1998), que demonstraram um maior número de células nervosas no plexo mioentérico durante a desnutrição. E também com os resultados encontrados por Furlan et al. (1999), onde demonstraram um aumento na densidade de neurônios NADH-dr em ratos submetidos ao diabetes.
A técnica da NADH-d é inspecífica do ponto de vista do fenótipo neurotransmissor dos neurônios evidenciados, baseia-se na condição bioquímica da célula: o termo NADH-d é genérico para enzimas capazes de oxidar NADH na presença de um aceptor artificial de elétrons (DORLAND et al., 1994). O aumento no número de neurônios NADH-dr no estômago dos animais do grupo q10 sugere uma alteração no metabolismo neuronal tornando um grupo maior de neurônios mioentéricos reativos à técnica nas condições empregadas.
Os neurônios que sintetizam NO, tanto no sistema nervoso central quanto no periférico, podem ser visualizados pelo emprego da histoquímica NADPH-d (DAWSON et al., 1991; BELAI et al., 1992; JOHNSON et al., 1998) e compõe uma fração significativa da população neuronal mioentérica total em qualquer segmento do tubo digestório (FURLAN et al., 1999). Desta forma a estrutura do plexo evidenciado pelo NADPH-dr foi semelhante à aquela relatada em outras investigações (BELAI et al., 1992; WESER et al., 1999), em que não só os corpos celulares mas também os feixes nervosos foram visualizados.
O número de neurônios mioentéricos NADPH-dr aumentou 27% no grupo q10 comparado com grupo c10. Desta maneira percebeu-se um aumento no número de neurônios em animais que foram queimados, porém a sua aparência deixa evidente que há algo nessas células nervosas que está comprometido, visto a aparência crenada do contorno citoplasmático. Sendo assim, a função desempenhada por esses neurônios que é a inibição do músculo liso no estômago, que é essencial para a progressão das ondas peristálticas e para o controle da passagem do conteúdo de um segmento digestório para outro (COSTA e BROKES, 1994; KUTCHAI, 2000), pode ter sido alterado.
Em se tratando de perfil neuronal, a presente pesquisa, revelou diferenças significativas na área dos perfis neuronais nos animais dos grupos c10 comparados
ao grupo q10, onde neste último foram menores, tanto nos avaliados pelas técnicas histoquímicas do NADH-d como do NADPH-d.
Dados dos estudos de Molinari et al., 2004, concordam com os resultados deste trabalho, onde ao estudar os efeitos do alcoolismo crônico nos neurônios NADH-d do plexo mioentérico do estômago de ratos, observou uma diminuição no número de neurônios grandes e aumento de neurônios pequenos com prevalência de neurônios de tamanho médio.
Corrobora também com estes dados Maifrino, (1996), que ao analisar os aspectos da infecção no plexo mioentérico do colo de camundongos pelo
Trypanosoma cruzi, onde verificou uma diminuição do tamanho do corpo celular nos
animais do grupo infectado.
Através da MEV, e posterior confirmação morfométrica, quando se confirmou uma maior espessura da mucosa gástrica para o grupo q10, pode-se inferir um comprometimento do esvaziamento gástrico o que, supostamente, levaria a um aumento na concentração ácida no interior da víscera, colaborando para o aparecimento de ulcerações. Muito embora ulceraões não tenham sio detectadas no período estudado, os dados permitem concordar com Alican et al. (1995), que verificaram uma concentração de soluções ácidas e peptonas significativamente maiores no interior do estômago de ratos que sofreram LTC e com as afirmações de Mochizuki et al., 1984; Deitch, 1990; Varedi et.al., 1999, no ntestino delgado, onde a LTC resultou em alterações morfológicas, funcionais e grandes alterações na mucosa. Na região das criptas, as células se apresentam linearmente com diferentes potenciais de proliferação e são sensíveis à LTC, com alterações na posição e proliferação celular após o estresse. (IJIRI e POTTEN, 1983; IJIRI e POTTEN 1987; POTTEN et.al., 1994)
Vários autores têm relatado a dilatação e a hipotonia gástrica com diminuição no esvaziamento gástrico (CESARINI et al., 1997; CAMILLERI, 2002; De BLOCK et. al., 2002). Sendo o NO um neurotransmissor inibitório, quando aumentado poderia intensificar o relaxamento da musculatura gástrica, com conseqüente diminuição no esvaziamento favorecento a gastroparesia. Faz-se necessário, entretanto, investigar se a gastroparesia decorre de um aumento excessivo da produção de NO ou se é a redução da atividade colinérgica que causa a hipomibilidade, ou ainda se os dois fatores se somam para produzir os sintomas. Cesarini et. al. (1997) relatam melhora dos sintomas com uso de agentes colinérgicos, por outro lado, em humanos, os
efeitos de um doador de NO sobre o esvaziamento gástrico foi avaliado, sendo observada a inibição da motilidade pilórica com diminuição do esvaziamento gástrico (SUN et. Al., 1998). Kuiken et al. (2002) administrando um inibidor da óxido nítrico sintase em humanos saudáveis, observaram diminuição do volume fúndico basal após refeição. Os autores concluem que o NO está envolvido na manutenção do tônus fúndico e no relaxamento fúndico induzido pelo alimento. Coulie et. al. (1999) relacionam a manutenção do tônus fundico com um balanço na ativação de vias colinérgicas e nitrérgicas em gatos.
Varedi et al. (2000) concluiu em seus estudos no intestino delgado de ratos, que a LTC, induz à apoptose nas regiões proliferativas e uma diminuição da atividade mitótica nas criptas, estas regiões são de grande importância para a manutenção da homeostase epitelial (POTTEN 1991; POTTEN 1997). Observaram também uma elevação na permeabilidade gastrintestinal o que pode contribuir para a translocação de bactérias e endotoxinas associadas através da linfa mesentérica, o que pode aumentar o risco de septicemia.
Sendo assim, na presente pesquisa acredita-se que o esvaziamento gástrico foi comprometido devido a uma soma de fatores, onde apesar do aumento dos neurônios NADPH-dr, a expressão do VIP, um neurotransmissor que associado ao NO causa inibição da musculatura lisa, diminuiu, indicando um hipotonismo gástrico. Da mesma maneira, a imunoreatividade da SP foi diminuída, este neurotransmissor atua também na estimulação da contração da musculatura lisa e de secreção de substâncias. Desta forma a gastroparesia resultou em ulcerações na mucosa gástrica.
A constituição morfológica de tecido conjuntivo com fibras colágenas envolvendo o gânglio mioentérico com escassas fibras elásticas foi observada neste trabalho. Resultado semelhante foi obtido por Oliveira et. al. (2000) ao estudar o estômago de ratos, essa disposição e constituição morfológica é também descrita em galinha (GABELLA e HALASY, 1987), e em patos (MOLINARI et al., 1994). O aumento de fibras colágenas e no grupo q10 deve ser um efeito protetor no gânglio e também na mucosa onde foi densamente agredida.
A análise dos resultados relativos à mucosa gástrica e aos componentes do plexo mioentérico do estômago de ratos submetidos à LTC, permite concluir que:
1 A LTC alterou a ingesta alimentar, levando à perda de peso corporal nos animais do grupo q10.
2 O número de neurônios NADH-dr apresentou-se aumentado no grupo q10, o que ocorre devido a uma diminuição do tamanho do órgão devido a uma ação associada de NO, VIP e acetilcolina.
3 O número de neurônios NADPH-dr aumentou no grupo q10; porém, seu contorno citoplasmático apresentou-se crenado, sugerindo comprometimento na síntese dessa substância.
4 Houve diminuição no número de neurônios grandes e aumento de neurônios pequenos no grupo q10 tanto para a reação da NADH-d como da NADPH-d.
5 A reatividade para a AChE foi fraca para a maioria dos neurônios médios e grandes do grupo q10, onde apenas neurônios pequenos aparecem reativos. Além disso, o contorno dos neurônios médios e grandes não apresentou-se bem definido.
6 A imunoreatividade ao VIP e à SP apresentou menor intensidade no grupo q10, sugestivo de menor ação neurotransmissora.
7 A mucosa gástrica apresentou-se mais espesa no grupo q10, o que pode comprometer o esvaziamento gástrico.
8 Ocorreu um aparente aumento de fibras colágenas do tipo I nos animais q10, talvez devido ao aumento da espessura da mucosa observado para esses animais.
9 Qualitativamente, houve um aumento de fibras colágenas do tipo I e elásticas maduras na cápsula ganglionar dos animais do grupo q10.
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