3.1 Obtenção da microalga Spirulina platensis e meio de cultivo
As cepas da microalga S. platensis, utilizadas no experimento, foram obtidas no laboratório de Planctologia do Departamento de Engenharia de Pesca da Universidade Federal de Ceará, onde também foram realizados os cultivos.
Para o preparo do meio de cultivo, foram utilizados cloreto de sódio (30 g L-1),
bicarbonato de sódio (10 g L-1) e os fertilizantes agrícolas, nitrogênio, fósforo e potássio - NPK (1 g L-1) e superfosfato triplo (0,1 g L-1). Após serem pesados e macerados, eles foram, gradativamente, adicionados e dissolvidos em água clorada dentro de um recipiente plástico com um volume de 120 L. Em seguida, o meio foi submetido a aeração constante por 24 horas para homogeneizar bem a mistura e eliminar o cloro contido na água. A salinidade do meio de cultivo foi monitorada com um refratômetro portátil.
3.2 Cultivo da microalga Spirulina platensis
A partir de um cultivo de S. platensis mantido no laboratório de Planctologia, foi obtido o inóculo inicial transferindo-se 300 mL de um cultivo pré-estabelecido para um erlenmeyer de 1 L. Em seguida, foi adicionado, a cada dois dias, meio de cultivo até completar o volume do recipiente. O inóculo foi mantido sob iluminação constante de 39,1 µE cm-2 s-1, avaliada com um luxímetro digital, temperatura de 28 ± 2°C e, diariamente, foi agitado manualmente até que a densidade celular alcançasse valores semelhantes àquela do cultivo pré-estabelecido. Após este período, o inóculo foi transferido para um garrafão de 14 L, sendo novamente adicionado meio de cultivo. Durante todo o trabalho, foram utilizados como inóculos dois recipientes de 1 L e um garrafão de 14 L que teve seu volume distribuído igualmente entre seis aquários de 20 L para a produção da microalga em maior escala e sob diferentes condições de fotoperíodo.
O primeiro cultivo foi submetido a um fotoperíodo de 8 h de claro e 16 h de escuro, o segundo a 12 h de claro e 12 h de escuro, o terceiro a 16 h de claro e 8 h de escuro e
o quarto submetido a 24 h de iluminação constante. Todos os cultivos foram realizados com seis repetições em duas incubadoras cada uma com três aquários. Os aquários foram dispostos lado a lado, em cada incubadora de madeira para garantir total proteção contra a luz ambiente ou externa, na temperatura ambiente de 28 ± 2°C mantida com auxilio de um “cooler”. A iluminância na superfície da água foi de 78,1 µE cm-2 s-1 fornecida por duas lâmpadas fluorescentes de 40 W, e todos os aquários receberam aeração constante.
3.3 Acompanhamento do cultivo e obtenção das curvas de crescimento
O monitoramento do cultivo foi feito pela contagem do número de filamentos (tricomas) em alíquotas de 5 µL e por espectrofotometria, utilizando neste último caso uma amostra de 1 mL para a leitura da absorbância no comprimento de onda de 680 nm. Os tricomas foram contados através de varredura em lâmina de vidro no microscópio óptico comum com aumento de 100 a 200 vezes, dependendo do comprimento dos filamentos. Os valores médios de absorbância a 680 nm e respectivos números de tricomas foram submetidos a análises de correlação e regressão, considerando um nível de significância ( ) igual a 5%, e as curvas de crescimento foram ajustadas através do programa Origin Professional 6.0.
A separação das microalgas do meio de cultivo foi realizada por filtração em malha de 60 m, através de sifonamento no final da fase exponencial de crescimento do cultivo. A biomassa úmida coletada foi lavada com água destilada, para eliminar o sal e armazenada a 4°C por 24 h. Após esse período, uma parte da biomassa foi congelada e liofilizada para obtenção da biomassa desidratada. Após este procedimento, a biomassa seca foi armazenada em frascos de cor escura protegidos da luz para posterior extração dos carotenóides e tocoferóis.
Antes do início de cada cultivo, os aquários eram completamente esvaziados e escovados com detergente neutro, seguido de um enxágue com água doce clorada em abundância.
3.4 Preparação dos extratos, saponificação e partição
Três porções de 0,1 g de Spirulina cultivada em laboratório nas quatro condições de fotoperíodo foram pesadas separadamente. A extração dos carotenóides e tocoferóis foi realizada em tubos de vidro graduado com tampa esmerilhada (20 x 150 mm) a partir de amostras de Spirulina liofilizadas em 10 mL de metanol:água Milli-Q (90:10, v/v) contendo 7% de hidróxido de potássio. Para a saponificação da amostra, o material foi homogeneizado e deixado em banho-maria a 70°C por 30 min. Depois de resfriados à temperatura ambiente, os extratos foram centrifugados a 2.000 x g por 5 min. Após a centrifugação, 1,5 mL de água Milli-Q, 2,5 mL de n-hexano e 5 mL dos extratos saponificados foram transferidos para tubos Pyrex de tampa rosqueada (15 x 100 mm) e submetidos a agitação em uma plataforma misturadora por 10 min para permitir a migração dos compostos não saponificáveis do metanol para o n-hexano.
Os tubos foram deixados em repouso e, em seguida alíquotas de 1 mL da fase hexânica foram transferidas para tubos de ensaio (10 x 75 mm) e levados à evaporação completa do solvente. O resíduo de cada tubo foi então suspenso em 1 mL de metanol, filtrado em membrana de 0,45 m Chromafil® CA – 45/25 S, no momento da análise por cromatografia líquida de alta eficiência.
3.5 Soluções padrão de -caroteno, –tocoferol e -tocoferol
Os padrões comerciais -caroteno tipo I sintético all-trans (C-9750), -tocoferol sintético (T-3251) e -tocoferol (T-2028) foram obtidos da Sigma, Estados Unidos. Os solventes (metanol, n-hexano e tetrahidrofurano) utilizados na preparação dos padrões e nas análises cromatográficas foram grau CLAE, obtidos da J. T. Baker, Estados Unidos, o hidróxido de potássio foi obtido da Merck, Alemanha e todas as soluções experimentais foram preparadas utilizando-se água ultrapura, obtida através do sistema Milli-Q (Millipore, Estados Unidos).
Diariamente, uma solução padrão de -caroteno (1 mg mL-1), em tetrahidrofurano,
foi preparada e diluída com metanol para 10 µg mL-1 de modo que 0,5 µg de -caroteno fosse
determinada a partir de sua absorbância em 450 nm (CRAFT; SOARES JR, 1992). Da mesma
forma, cotidianamente soluções padrão de - e de -tocoferol (1 mg mL-1) foram preparadas e diluídas para 100 µg mL-1 em metanol, de modo que 5 µg de cada um desses compostos fossem injetados na coluna. As soluções diluídas foram chamadas de soluções padrão de trabalho.
As soluções padrão de trabalho de -caroteno (10 µg mL-1), -tocoferol (100 µg mL-1) e -tocoferol (100 µg mL-1) foram submetidas à saponificação e partição em n-hexano separadamente e na presença de 0,1 g de S. platensis liofilizada, de forma idêntica àquela das amostras de microalga.
3.6 Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa
O sistema cromatográfico consistiu em uma coluna Waters Spherisorb S5 ODS2 (4,6 x 250 mm) e uma fase móvel constituída de metanol:tetrahidrofurano (90:10, v/v), com fluxo de 1,5 mL min-1, usando uma bomba (AKTAbasic 10, modelo P-900, Amersham).
Alíquotas de 100 L do resíduo suspenso em metanol foram injetadas manualmente usando um injetor de amostras Rheodyne 7210 (Hamilton Co.). O monitor (AKTAbasic UV-900) foi ajustado para a leitura simultânea de - e - tocoferol em 292 nm e de -caroteno em 450 nm. Os cromatogramas foram registrados através do sistema de controle UnicornTM, versão 5.0
3.7 Cálculo dos teores de -caroteno, -tocoferol e conversão em retinol equivalente (RE) e tocoferol equivalente (TE)
Os teores de -caroteno e -tocoferol foram calculados considerando-se a relação entre suas quantidades presentes nos extratos da microalga e as áreas dos picos obtidas para as concentrações conhecidas dos padrões comerciais ( -caroteno 10 µg mL-1 e -tocoferol 100 µg mL-1), submetidos à saponificação e partição. Os resultados foram obtidos utilizando a
a lg microa peso g 1 diluição de fator padrão caroteno g padrão caroteno pico área a lg microa extrato pico área g g 1
Os cálculos de retinol equivalente (RE) e tocoferol equivalente (TE) foram calculados com base na legislação brasileira (BRASIL, 2005), e utilizados para classificar as microalgas em fontes excelentes (1/2 da IDR) ou úteis (1/6 da IDR) (RICHARDSON, 1990).
3.8 Análise estatística
Os teores de -caroteno e -tocoferol encontrados nos extratos de Spirulina foram submetidos à análise de variância unifatorial (ANOVA), seguida do teste de Tukey, para comparação das médias, ambos considerando igual a 1%. A comparação dos tempos de retenção do padrão e dos extratos foi feita pelo teste t de Student para dados independentes. Todas as análises foram feitas com auxílio do Programa BioEstat 4.0 e a aplicação dos testes estatísticos obedeceu às recomendações de Ayres et al. (2005).