As atividades de pesquisa não clínica foram realizadas no Laboratório de Ensaios Toxicológicos (LABETOX) e no Biotério Prof. Dr. Thomas George do Instituto de Pesquisa em Fármacos e Medicamentos-IPeFarM-UFPB. Outras atividades foram realizadas nos laboratórios de análises clínicas e patologia clínica do Hospital Universitário Lauro Wanderley da UFPB.
3.2 Materiais
3.2.1 Material botânico
O Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz Dioclea grandiflora foi preparado no Laboratório de Química de Produtos Naturais do Instituto de Pesquisa em Fármacos e Medicamentos (IPeFarM-UFPB) . Após a coleta do material, as cascas foram submetidas a um processo de extração utilizando o aparelho de Soxhlet, por um período de 24 horas, sendo o solvente extrator uma solução de etanol a 95% e concentrados em evaporador rotatório em uma temperatura de 60 ºC.
3.2.2 Animais
3.2.2.1 Ratos Wistar
Durante os ensaios, foram utilizados ratos Wistar (Ratus novergicus), albinos, adultos, machos e fêmeas (nulíparas e não grávidas), pesando entre 180 e 220 gramas, fornecidos pelo biotério Prof. Thomas George do Instituto de Pesquisa em Fármacos e Medicamentos (IPeFarM-UFPB). Os animais foram agrupados em gaiolas de polietileno, mantidos sob condições controladas de temperatura de 25 2oC, sem uso de qualquer
medicamento, tendo livre acesso à comida (tipo pellets de ração da marca Purina®) e água
gaiolas na sua parte superior. Os animais foram mantidos em ciclo claro-escuro de doze horas. Projeto aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal sob número 0404/2010.
Figura 01 - Rato Wistar
3.2.3 Aparelhagem
Analisador bioquímico automático – Cobas Mira Plus® - Roche Diagnostic
System - para determinações bioquímicas no soro;
Analisador de íons seletivos, Iselab®, para determinações dos íons sódio, potássio
e cálcio;
Analisador hematológico celular automático – Cobas Argos 50® - Roche
Diagnostic System - para obtenção de hemograma e dosagem de plaquetas. Os esfregaços sanguíneos foram corados automaticamente no HEMATEL 200® e
analisados em microscópio Olympus®, para confirmação e controle da contagem
de células;
Balança analítica marca AID® – HR – 120g – Japão;
Balança eletrônica BG – 8000 GEHAKA®;
Centrífuga BIO ENG® BE 4000, para separação do soro em dez minutos, a 3500
rpm;
Glicosímetro ACCU-CHEK performa : monitor de glicemia com fitas reativas; Microscópio RML5® Askmania-Germany, utilizado nas análises histopatológicas;
Termômetro digital, modelo MC – 3BC®, OMRON/China;
Aparelho do Rota-rod para a avaliação da capacidade motora dos animais; Aparelho do campo aberto (Open Field).
Figura 02 - Analisador bioquímico automático Cobas Mira Plus® - Roche
Figura 03 - Aparelho de Rota-rod
3.3 Metodologia
3.3.1 Ensaio toxicológico não clínico agudo
Os ratos Wistar selecionados foram divididos em dois grupos: grupo controle e grupo tratado. Cada grupo era formado por 12 animais, sendo 6 machos e 6 fêmeas. O grupo controle foi distribuído em duas caixas separando os animais por sexo, e a estes animais foi administrado o veículo de diluição do extrato (a água). Os grupos que foram tratados estavam distribuídos igualmente e foram submetidos a uma única dose de 2000 mg/kg do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) por via oral (gavagem).
Após a administração do EEBCRDg, foi realizada a observação de parâmetros comportamentais através da triagem farmacológica para se detectar sinais de atividade no Sistema Nervoso Central nos intervalos: 30, 60, 90, 120, 180 e 240 minutos. Segundo protocolo experimental elaborado pelo Setor de Psicofarmacologia do Instituto Pesquisa em Fármacos e Medicamentos (IPeFarM-UFPB) e descrito por Almeida et al (1999). Diariamente, foi avaliado o consumo de água e ração consumida, enquanto que a evolução ponderal foi verificada semanalmente dos animais, em ambos os sexos, desde a 24ª hora e até 14 dias após a administração da dose única.
Após o 14º dia, os animais foram eutanasiados por tração cervical, sendo retirado o sangue para análise laboratorial de parâmetros hematológicos e bioquímicos.
3.3.1.1 Análise laboratorial do sangue
A coleta das amostras foi realizada através de sangria do plexo braquial, e o sangue foi coletado em tubos com o anticoagulante ácido etilenodiamino tetracético (EDTA), para a determinação dos parâmetros hematológicos, e em tubos com gel separador - Microtainer Becton Dickson - para a obtenção do soro e posterior determinação dos parâmetros bioquímicos.
3.3.1.1.1 Parâmetros hematológicos
branca (leucograma) e contagem de plaquetas. No eritrograma foi realizada a contagem de hemácias, determinação do hematócrito, da hemoglobina, do volume corpuscular médio (VCM), da hemoglobina corpuscular média (HCM), e da concentração da hemoglobina corpuscular média (CHCM). No leucograma realizou-se a contagem global dos leucócitos e da diferenciação celular. Estas determinações foram realizadas no analisador celular COBAS ARGOS 50-ROCHE. Os esfregaços sanguíneos foram corados automaticamente no HEMATEL 200 e analisados em MICROSCÓPIO Olympus, para confirmação e controle da contagem de células.
3.3.1.1.2 Parâmetros bioquímicos
As análises bioquímicas foram realizadas em amostras de soro utilizando analisador bioquímico automatizado COBAS MIRA PLUS- ROCHE. Foram determinadas as dosagens da glicose, uréia, colesterol total, triglicerídios, ácido úrico, creatinina, transaminases: Aspartato Amino Transferase (AST) e Alanina Amino Transferase (ALT), fosfatase alcalina, proteínas totais e frações, lactato-desidrogenase (LDH), amilase e creatina quinase.
3.3.2 Ensaio toxicológico não clínico crônico
No ensaio crônico, a substância é administrada diariamente, em diferentes doses a vários grupos de animais por um período de 90 dias (BRITO, 1994). Os parâmetros a serem avaliados foram orientados conforme “Guia de orientação para registro de medicamento fitoterápico e registro e notificação de produto tradicional fitoterápico” da ANVISA. Animais pré-selecionados foram distribuídos em 4 grupos contendo 20 animais por grupo (10 machos e 10 fêmeas). Os animais foram distribuídos em gaiolas separados por sexo, permanecendo 5 animais por gaiola totalizando 16 gaiolas durante o ensaio crônico. Os grupos foram distribuídos da seguinte maneira conforme quadro 03:
Grupo controle, caixas de 01 a 04, que foi tratado diariamente com água, veículo utilizado na dissolução do EEBCRDg.
Três grupos foram tratados diariamente durante 90 dias, no turno da manhã, por via oral (gavagem) da seguinte forma: caixas de 05 a 08 com a dose de 10 mg/kg;
caixas de 09 a 12 com a dose de 50 mg/kg, e caixas de 13 a 16 com a dose de 250 mg/kg do EEBCRDg.
Quadro 03 - Sistema de organização, Sendo caixas impares as fêmeas e caixas pares os
machos
Caixa 01 Caixa 02 Caixa 03 Caixa 04
Caixa 05 Caixa 06 Caixa 07 Caixa 08
Caixa 09 Caixa 10 Caixa 11 Caixa 12
Caixa 13 Caixa 14 Caixa 15 Caixa 16
Os efeitos da administração prolongada do EEBCRDg foram avaliados sobre parâmetros como: temperatura, glicemia, consumo de água e alimentos, evolução ponderal, atividade exploratória e motora dos animais, parâmetros hematológicos, bioquímicos, e ainda foram realizados exames histopatológicos de órgão dos animais. Os resultados foram comparados com os dados obtidos no grupo controle e com dados da literatura.
3.3.2.1 Temperatura
A temperatura corporal foi medida utilizando-se um termômetro digital modelo MC – 3BC®– ORON/China, cujo termosensor foi lubrificado com vaselina líquida e introduzido 5
cm pelo reto (atingindo o cólon). Este parâmetro foi avaliado uma vez por mês em todos os animais, durante os 90 dias de tratamento.
3.3.2.2 Glicemia
Os níveis glicêmicos dos animais foram avaliados uma vez por mês durante os 90 dias do ensaio crônico da seguinte forma: os ratos eram imobilizados em contensores plásticos e uma gota de sangue era coletada da veia caudal e analisada em fita reativa para dosagem de glicemia. A leitura foi efetivada em monitor de glicemia ACCU-CHEK performa Marca Roche, sendo observado jejum prévio de 12 horas.
3.3.3.3 Consumo de água e alimento e avaliação ponderal
Neste experimento avaliou-se o consumo de água e de ração pelos animais, em ambos os sexos, nos 90 dias de tratamento. Diariamente, eram colocados 250g de ração e mamadeiras graduadas contendo 500 mL de água nas gaiolas e, no dia seguinte, sempre pela manhã, o volume de água ingerido pelos animais era registrado e contabilizado o peso consumido de ração. A pesagem dos animais foi realizada semanalmente para ajuste da dose testada.
3.3.3.4 Avaliação comportamental (Teste do Campo Aberto) e Motora (Teste no Rota-rod)
Na avaliação comportamental foi utilizado o aparelho de campo aberto, seguindo o descrito por Carlini et al.,(1986) para analisar a atividade exploratória dos animais através:
Da movimentação espontânea (ambulação), registrada pelo número de cruzamentos, com as quatro patas, entre as divisões do campo;
Da quantificação dos comportamentos de auto limpeza, de levantar e a defecação (número de bolos fecais).
Este teste foi realizado quinzenalmente, uma hora após a administração do extrato, com animais tratados e animais controle que foram expostos (durante 3 minutos para cada animal) ao aparelho para a observação dos parâmetros acima descritos (MANSUR et al., 1971).
Também, quinzenalmente, uma hora após administração do EEBCRDg, os animais do grupo controle e tratado foram colocados na barra giratória do aparelho Rota-rod, com velocidade constante de 9,0 rpm, e registrado o tempo de permanência dos mesmos, com até três reconduções no aparelho.
Deve-se levar em consideração que cada teste foi realizado com metade do grupo, ou seja, 10 animais por dose (5 machos e 5 fêmeas) e que antes de iniciar o experimento crônico com a administração do EEBCRDg, os animais foram selecionados de acordo com o peso corporal aproximadamente 200g, e foram submetidos ao aparelho de rota-rod com a finalidade de observar aqueles que estivessem aptos a participarem dos testes.
3.3.3.5 Avaliação laboratorial do sangue
Após o término do experimento para avaliação da toxicidade crônica, foram coletadas amostras de sangue, através de sangria do plexo braquial, dos animais, machos e fêmeas, dos grupos tratados com EEBCRDg (doses 10; 50 e 250 mg/kg/dia) e do grupo controle. O sangue foi coletado em tubos contendo anticoagulante EDTA para avaliação dos parâmetros hematológicos (hemograma e contagem das plaquetas) e em tubos contendo gel separador, que foram centrifugados por 10 minutos a 3500 rpm, para obtenção do soro, destinado a análises bioquímicas de glicose, uréia, creatinina, transaminases AST e ALT, colesterol, triglicerídios, ácido úrico, fosfatase alcalina, proteínas totais e frações, cálcio e magnésio, sendo observado um jejum de 12 horas antes da coleta de sangue.
3.3.3.6 Exame anatomopatológico
Animais do ensaio crônico foram sacrificados por tração cervical e tiveram suas vísceras coletadas e examinadas macroscopicamente. O cérebro, coração, fígado e rins foram seccionados por incisão sagital e os pulmões, submetidos à perfusão via traquéia, com solução de formol a 10%. Após 12 horas de fixação, foram obtidas as amostras necessárias para processamento histopatológico, empregando-se técnica de inclusão em parafina e coloração em hematoxilina-eosina, para análíse morfológica.
4 RESULTADOS