Este trabalho dividiu-se em três fases. A primeira fase consistiu na obtenção de diferentes linhas de D. melanogaster. Na segunda fase do trabalho testou-se diferentes tempos de exposição das moscas a plasma não térmico, de modo a averiguar qual o tempo de exposição mínima e máximo mais adequado de modo a alcançar os objetivos propostos. Na terceira fase as larvas foram expostas aos tempos mínimos e máximos estabelecidos anteriormente, tendo procedido ao registo de todas as alterações comportamentais e morfológicas observáveis nas lavas após a exposição. Foram seguidas todas as pupas e adultos resultantes das larvas sobreviventes à exposição.
5.1 Linhas de Drosophila melanogaster
5.1.1 Linhas selvagens
Começou-se por recolher as moscas no Campus Universitário da Penteada em três momentos diferentes. Posteriormente, estas moscas foram separadas de modo a formar diferentes linhas de D. melanogaster (linha “isofemale”). As fêmeas foram mantidas individualmente em frascos contendo meio de alimentação preparado com agar 1,2g/100ml (Agar agar, V. Reis, Limitada), açúcar 12,5g/100ml, fermento 0,85g/100ml, milho 9g/100ml e nipagin M 0,4g/100ml (éster metílico do ácido p- hidroxibenzóico, NIPA, José M. Vaz Pereira, Lda) dissolvidas em água.
Os filhos produzidos (geração F1) foram separados 8-10 horas após a eclosão
colocados em frascos aos pares (cruzados entre si) de modo a formar diferentes linhas de Drosophila. As diferentes linhas foram identificadas como linha 1, linha 2, etc. Este procedimento foi repetido durante 5 gerações, de modo a obter uma linha pura (para que todos os indivíduos sejam em princípio geneticamente idênticos). As linhas foram transferidas para frascos contendo um meio novo a cada 2-3 semanas, de modo a ter sempre larvas frescas para a exposição do plasma. Todos os frascos foram guardados na estufa a 22⁰ C. A linha 10 foi escolhida entre as linhas estabelecidas para prosseguir com a experiência.
5.1.2 Linha laboratorial
Para confirmar os resultados observados, o trabalho de exposição de larvas ao plasma foi repetido, usando uma linha laboratorial. A linha usada foi de D. melanogaster (laboratori Fabra), cedida pela Universidade de Barcelona/Departamento de Genética. As moscas foram mantidas nas mesmas condições descritas anteriormente. Esta linha foi designada de linha Barcelona.
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5.2 Equipamento experimental para aplicação do plasma
O plasma não térmico à pressão atmosférica foi produzido por um equipamento desenhado e montado para esse efeito, apresentado na figura 13. Para uma aplicação de 10 segundos, o plasma gerado tinha uma amplitude máxima de 4 w e a dose foi de 8 J/cm2. Este equipamento é constituído por duas partes:
Um gerador de alta tensão.
Um dispositivo de descarga de barreira dielétrica.
A injeção de corrente elétrica no enrolamento primário de um transformador produz sinais de alta tensão. O dispositivo de descarga dielétrica é constituído por 2 elétrodos de cobre e duas placas de mica. Um gerador de alta tensão alimenta a descarga que ocorre no espaço entre os dielétricos. A informação anteriormente descrita foi gentilmente cedida pelo professor Doutor Gabriel Lira.
Figura 13: Esquema do dispositivo de descarga dielétrica: G-gerador de alta tensão, e1 e e2-elétrodos de
cobre, d1 e d2-placas de mica.
5.3 Preparação das larvas para exposição
Foram retiradas dos frascos pequenas porções de meio que continham as larvas, que foram colocadas em caixas de Petri. As larvas foram inicialmente separadas com uma agulha com ponta de metal. Posteriormente, utilizou-se um pincel para evitar magoá-las e desta forma estar a influenciar os resultados. Foram colocadas em caixas de
Petri, contendo papel de filtro humedecido com água. Imediatamente após a separação
foram transportadas em caixas para o laboratório de exposição. 5.4 Aplicação do plasma
No laboratório de exposição as larvas foram separadas em grupos de 10 indivíduos e colocadas num caixa própria, construída para a exposição do plasma. Após cada exposição, as larvas foram retiradas com um pincel e colocadas novamente em caixas de
Petri forradas com papel de filtro humedecido com água e transportadas para o
laboratório de trabalho.
5.5 Separação das larvas para caixas de crescimento
Imediatamente após à exposição, as larvas foram separadas por estádio de desenvolvimento.
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Os critérios para a separação dos diferentes estádios de desenvolvimento foram: as diferenças do tamanho do aparato bucal (que é mais pequeno nas larvas de 1.º estádio), os espiráculos anteriores (uma vez que nas larvas de 3.º estádio estes estão abertos tipo dedos de uma mão, enquanto nas larvas de 2.º estádio estão fechados), assim como os espiráculos posteriores, que nas larvas de 3.º estádio apresentam um anel cor de laranja.
Uma vez separadas, as larvas foram colocadas em grupos de 10 larvas em caixas de
Petri de 50 mm contendo meio de alimentação. As caixas foram colocadas na
incubadora a 23o C e observadas a cada 24 horas.
5.6 Observação após exposição
As larvas foram observadas diariamente deste a fase larval até à fase adulta. As larvas com anomalias encontradas em cada observação foram separadas individualmente para novas caixas. Todas as caixas foram seguidas diariamente e todas as alterações foram registadas. Para o efeito foi utilizado uma lupa Wild M3B. As larvas mortas foram separadas e feitas preparações definitivas com as que apresentaram anomalias para observação posterior. As fêmeas com ovários desenvolvidos e com ovos e os machos com testículos normais e presença de espermatozóides serão considerados férteis.
As lâminas foram observadas e analisadas recorrendo a um microscópio óptico SWIFF M4000-D. Foram tiradas fotografias diárias dos resultados obtidos. As fotos foram tiradas com uma câmara digital Sony SteadyShot DSC-W320, 14,1 Mega Pixels. 5.7 Testes estatísticos
Os dados foram tratados com o teste estatístico qui quadrado. Este teste foi usado para avaliar se as diferenças entre os grupos expostos e o controlo foram ou não significativas. Posteriormente foi feita a correção de Bonferroni. Esta correção permite verificar quais os resultados que são verdadeiramente significativos.