2.1 KONKURRERENDE FLYTENDE VINDTURBINKONSEPTER
2.1.2 Njord
Este ensaio de alimentação teve como objetivo avaliar o efeito do dsRNA dos novos genes alvo sobre as lagartas e compará-los aos 3 genes anteriores. Este ensaio foi realizado em triplicata biológica e para a avaliação do efeito foi realizada a pesagem das lagartas (N=30) após 5 dias de alimentação nos folíolos que absorveram o dsRNA dos respectivos
fragmentos gênicos. O RNA total destas amostras de larvas também foram extraídos e submetidos a análise quantitativa de transcritos reversos (Figura 30).
Figura 30 – Gráficos da expressão relativa (A) e do peso das lagartas (B) após 5 dias de tratamento dos respectivos genes-alvo utilizados nos ensaios de alimentação em relação ao gene controle GFP. Estão representados os valores médios com as barras de erro mostrando o desvio padrão entre as amostras, médias seguidas de * ou ** diferem a p < 0,05 e p < 0,01 respectivamente no teste T student (N=3). Amostras foram normalizadas com o gene Rpl5
Por este ensaio, pode-se observar um expressivo retardo de crescimento das lagartas, evidenciado pelo menor peso total das lagartas em relação ao grupo controle (GFP) em todos os genes-alvo testados de uma maneira muito similar, variação de 30% a 50% do peso do
1 ** * * * * 0 0.5 1 1.5 2 2.5 GFP ATPase AK EcR 592 2594 4623 1360 4303 Exp re ssão re la ti v a Genes
A
** ** ** ** ** ** ** ** 0 2 4 6 8 10 12 GFP ATPase AK EcR 592 2594 4623 1360 4303 P e so (m g ) GenesB
grupo controle. Apesar deste significativo efeito observado em todos os tratamentos, nem todos os candidatos apresentaram um silenciamento gênico específico que seria esperado como causa deste efeito, exemplo os genes AK, 592 e 1360. Mais intrigante o caso do gene AK, que foi o candidato em que as lagartas apresentaram a menor média de peso e em contraste teve a maior média de expressão (cerca de 150% em relação ao controle), com uma oscilação muito acentuada. Um dos motivos que poderia explicar este fato seria a super expressão do gene AK, como uma resposta de algumas lagartas ao silenciamento gênico que provavelmente ocorreu nos primeiros dias de tratamento culminando com o retardo do crescimento observado.
5 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos através dos ensaios preliminares de herbivoria com plantas transgênicas, e nos ensaios de alimentação tanto com dsRNA sintetizado in vitro como com infiltração com agrobactéria transformada, sugerem que a técnica de RNAi através da ingestão de moléculas de dsRNA e/ou siRNA é funcional em Tuta absoluta e portanto pode ser usada como método de controle desta praga.
As metodologias para fornecimento das moléculas de RNAi, desenvolvidas durante este trabalho e utilizadas nos ensaios de alimentação, se mostraram satisfatórias em reduzir a quantidade de transcritos dos genes alvos correspondentes, sendo uma alternativa rápida e fácil para se testar e eficácia de diversos possíveis genes alvos de silenciamento e as consequências para o inseto.
A absorção de solução de dsRNA pela folha através do pecíolo supre a necessidade de se desenvolver dietas artificiais para este tipo de ensaio com este inseto, que apresenta limitações à criação em dieta artificial.
A técnica de agroinfiltração se mostrou uma valiosa ferramenta para se testar construções de silenciamento (cassetes inseridos em vetores de transformação), como por exemplo com diferentes genes e diferentes tamanhos de fragmentos do mesmo gene, em um ensaio relativamente simples e eficiente, antes de se investir em um longo e laborioso experimento de transformação genética de planta.
Cabe ainda ressaltar que os ensaios foram conduzidos somente com as folhas das plantas transgênicas T0, portanto são necessários ensaios com plantas homozigotas T2, com
diversas plantas inteiras para cada construção, para provar que o RNAi é capaz de controlar a
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