Nitrogenets kretsløp

Os métodos titulométricos para a determinação do L-AA são muito comuns e utilizam vários agentes oxidantes como o iodo, azul de metileno, N-bromosucimida, ferrocianeto de potássio e o DCIP [36-38]. A titulação directa com o corante DCIP na forma de sal sódico foi introduzida por Tilmans em 1930. É um dos métodos mais antigos e baseia-se na oxidação do L-AA pelo DCIP em meio ácido. O ponto final da titulação é determinado pela descoloração do DCIP (redução), que origina uma solução incolor a partir de uma solução rosa (Figura 6). O ponto de viragem desta titulação também pode ser determinado através da análise espectrofotométrica (518 nm) [4, 36]. Este método tem sido aperfeiçoado ao longo do tempo, mas continua a apresentar algumas limitações. A titulação quantifica apenas o L-AA presente na solução. O DHAA não será medido a menos que seja reduzido a L-AA e o método só pode ser aplicado em produtos com baixas concentrações de DHAA [36]. Este método não é aplicável a todas as matrizes, pois sofre de pouca especificidade. Por exemplo, não fará distinção entre L-AA e iso-AA por isso não pode ser usado para análise de vitamina C em alimentos processados e curados pois já contêm artificialmente o último composto [4]. A titulação com DCIP pode ser usada na análise de sumos de frutas frescos [45]. No entanto, extractos bastante coloridos de frutas e vegetais podem mascarar a mudança de cor no ponto de viragem da titulação. Nestes casos, deve ser incluída uma etapa de limpeza da amostra, visando retirar os corantes naturais [4, 36]. Este método pode também fornecer valores erróneos devido à presença de outros compostos redutores além do L-AA. Qualquer outra substância redutora naturalmente presente na amostra pode reduzir o corante. Substâncias naturalmente presentes nos frutos, como taninos, fenóis, iões metálicos (Cu (II), Fe (II), Mn (II) e Co (II)), tiosulfato, cisteína, glutationa e reductonas formadas pelo escurecimento não enzimático são oxidadas pelo corante. É aconselhável que a titulação seja feita de forma rápida para diminuir o efeito de interferência de outras substâncias redutoras (açúcares, entre outros). A alcalinidade da amostra também dificulta a determinação [4, 36, 37].

Apesar das suas desvantagens, este método é rotineiramente aplicado em todo o mundo para várias matrizes de alimentos devido à sua simplicidade e baixo custo. É

33 considerado um método oficial da AOAC (Association of Official Analytical Chemists) e é recomendado para a análise de L-AA de bebidas e sumos para fins de rotulagem nutricional (AOAC método oficial 967.21) [4, 44-46].

A iodometria é um dos mais importantes métodos de titulação redox, pois o iodo reage directa, rápida e quantitativamente com muitas substâncias orgânicas e inorgânicas [47]. A titulação iodométrica é aplicada para a determinação do L-AA em alimentos naturais, suplementos alimentares e fármacos, sendo recomendada pelas normas europeias (Autoridade Europeia de Segurança Alimentar - EFSA) e Farmacopeia Brasileira [48-50]. Este método baseia-se reacção oxi-redução do L-AA com iodato de potássio (KIO3) na presença de

iodeto de potássio (KI), utilizando o amido como indicador. O ponto final desta titulação é determinado após a oxidação total do ácido ascórbico presente na solução. O iodeto presente na solução reage com o amido, formando um complexo com uma intensa cor azul-violeta escuro, facilmente observável mesmo em concentrações mínimas do iodo [51, 52]. Este método encontra-se descrito pormenorizadamente nos resultados, uma vez que foi aplicado na análise das amostras. Embora os métodos de titulação sejam simples de usar, do ponto de vista analítico não é um método preciso, porque os erros de titulação são cumulativos. Tal como o método anterior, não é possível medir directamente a concentração do DHAA presente nas amostras. Estas limitações deram origem à procura de métodos alternativos mais específicos e de confiança [36].

2.6.2.2. Métodos Espectrofotométricos

As determinações espectrofotométricas directas baseiam-se na absorção na região do ultra-violeta (UV/vis). Até à década de 80 eram os métodos mais comuns para determinar o teor de L-AA em diversas amostras, tendo em conta o carácter redutor desta molécula [1, 3, 37]. Normalmente utilizam-se dois princípios básicos para a quantificação do L-AA: um indicador tipo redox (metal) ou cromóforo. O L-AA é capaz de reduzir alguns iões metálicos (Fe3+, Cu2+) produzindo soluções coloridas após a complexação. As mudanças de cor observadas facilmente a olho nu são medidas quantitativamente pelos aparelhos [4]. A redução do Fe3+ _{a Fe}2+ _{pelo L-AA é a reacção mais comum, resultando na formação de um}

complexo cromogénico azul intenso. É adicionado um agente quelante (2,29-dipiridina; 2,4,5- tripyridyl-5-triazina e ferrozina), que forma um complexo com o metal reduzido. A absorvância do complexo formado é então medida aos 700 nm [1, 3, 4]. Além destes, o reagente de Folin e fenol também são utilizados [1].

34 Os métodos com derivatização incluem os reagentes o-fenilenodiamina (OPDA) e 2,4- dinitrofenilhidrazina (DNPH) [4, 37]. A reacção de condensação do OPDA com o DHAA representa uma das reacções de derivatização mais úteis na quantificação da vitamina C [4]. Os ácidos ascórbico e desidroascórbico não fluorescem naturalmente. Este método exige a oxidação adicional do L-AA e subsequente derivatização [2, 10]. A reacção total produz um produto altamente fluorescente (fluoróforo) derivado da quinoxalina, o 3-(1,2- dihidroxietil)furo[3,4b]quinoxalina-1-ona (DFQ) (Figura 6). Os comprimentos de onda de detecção são fixados nos 355 nm para excitação e 425 nm para emissão (λEx = 335, λEm =425)

[2, 4, 10, 53-55]. Este novo procedimento melhorou a sensibilidade e especificidade dos métodos de vitamina C existentes no momento [4]. É um método vantajoso, pois fornece valores da vitamina C total e permite a quantificação do DHAA mesmo em quantidades mínimas [36]. Existem alguns compostos que podem induzir erros nos resultados deste método, nomeadamente, grupos cetónicos que reagem com o OPDA e reductonas formados pela reacção de Maillard. Deste modo, a análise por este método de alimentos sujeitos ao escurecimento não enzimático, pode fornecer resultados equívocos em relação ao teor de vitamina C [4, 37]. Interferências físicas na medição da fluorescência podem surgir na extracção de alimentos ricos em amido (batatas, milho, feijão). Extractos com amido mostram uma opalescência característica. O problema pode ser evitado com a adição de etanol ao extracto para precipitar o amido. A oxidação do L-AA pelo reagente de Norit, embora simples na abordagem, melhora significativamente a precisão do método. Este passo facilita o ensaio da vitamina C total nos produtos alimentares e diminui a interferência de outras substâncias, evitando outras etapas de limpeza morosas [4].

Outro procedimento utilizado é a oxidação da L-AA a DHAA e DKG, seguida da reacção destas moléculas com DNPH em meio fortemente ácido (Figura 6). Com a adição do ácido sulfúrico, forma-se um produto de cor vermelha intensa, o bis-2,4-dinitrofenil hidrazina, que é quantificado pela leitura aos 500 – 550 nm (520 nm é o mais comum). O DNPH é bastante específico para o DHAA e DKG, pois tem a capacidade de reagir mais rapidamente com estas moléculas do que os açúcares e outras substâncias redutoras. Além disso, tem a capacidade de minimizar a formação de ácidos cromogénicos que poderiam interferir na medição [4, 37]. Apesar das vantagens descritas anteriormente, esta metodologia não tem sido aplicada recentemente na análise de alimentos de uma forma tão extensiva como a derivatização com OPDA.

35 O O HO OH HO H OH O O O HO H OH O NH2 NH2 N N Derivatização OPDA

OPDA Ácido Desidroascórbico Ácido L-Ascórbico

Oxidação Oxidação O O O HO H OH O Ácido Desidroascórbico O2N NO2 H N H2N H₂SO₂ DNPH Derivatização DNPH O2N H N C C HC CHOH CH2OH C N HN NO2 O2N O Redução DCIP N O OH Cl Cl DCIP oxidado (rosa) N HO OH Cl Cl O O O HO H OH O Ácido Desidroascórbico DCIP reduzido (incolor) O O C H CH2OH OH O N NO2 DFQ

Figura 6 - Principais reacções do ácido L-ascórbico aplicadas na análise da vitamina C (adaptado da Fonte: [4]).

Os métodos descritos anteriormente, são relativamente rápidos, práticos e de baixo custo porque não exigem reagentes nem equipamentos sofisticados. No entanto, em todos os casos, estes procedimentos sofrem de falta de especificidade da reacção. A absorvância das amostras está sujeita à interferência de muitas substâncias que absorvam radiação UV no comprimento de leitura. Isto torna necessário a inclusão de procedimentos de limpeza o que torna o processo moroso [3, 4]. Já foi mencionado anteriormente que a rapidez de análise é importante no rigor da quantificação devido à degradação da vitamina C.

Uma variedade de enzimas tem sido utilizada para a conversão enzimática do L-AA a DHAA. A associação de enzimas a outros métodos como a espectrofotometria directa, OPDA e outras reacções de derivatização é bastante vantajosa pois permite quantificar especificamente o L-AA após a reacção [3, 4]. As enzimas disponíveis comercialmente em forma de kits, tornam o método enzimático simples e rápido. Apesar disso, continua a ser uma técnica com algumas limitações. Por exemplo, estudos comparativos [35, 56] entre o método enzimático e o HPLC concluíram que esta última técnica fornece resultados mais satisfatórios (maior recuperação do L-AA). Adicionalmente, o método HPLC é uma técnica mais simples, com menor consumo de reagentes e material. Com o método enzimático também não é possível determinar o teor de vitamina C total das amostras porque este não é capaz de reduzir o DHAA a L-AA [3, 56].

36