New perspectives and new requirements

Além de metodologias que avaliam a presença de estrutura genética em populações naturais, também foram desenvolvidos modelos estatísticos para a realização de teste de alocação (Assignment Tests) (PRITCHARD, STEPHENS e DONNELLY, 2000). O teste de alocação tenta atribuir, com certa probabilidade estatística, indivíduos de origem desconhecida para a sua população de origem com base em genótipos multi-loco do indivíduo e a probabilidade esperada desse genótipo ocorrer em cada uma das potenciais populações originais. Os pressupostos fundamentais são que todas as potenciais populações originais estão em equilíbrio de Hardy- Weinberg e equilíbrio de ligação (MANEL, GAGGIOTTI e WAPLES, 2005).

O poder de alocação em um teste é altamente dependente do tipo e do número de marcadores que está sendo utilizado (TURAKULOV e EASTEAL, 2003). Estudos teóricos têm avaliado quantos locos e quantos alelos são necessários para maximizar o sucesso de alocação. Em geral, conclui-se que a acurácia de alocação é boa mesmo quando utilizado um número modesto de locos com um número modesto de alelos (BANKS, EICHERT e OLSEN, 2003). Yang E Loopstra (2005) utilizaram microssatélites para alocar diferentes indivíduos em

populações de africanos americanos e europeus americanos e detectaram uma acurácia de alocação maior que 95% utilizando apenas seis marcadores.

A utilização de marcadores com alto poder informativo pode reduzir o número total de marcadores necessários para a realização com sucesso de alocação e inferência de ancestralidade. É interessante, portanto, avaliar o poder informativo de cada marcador para a realização desse tipo de análise. Em seres humanos, comparando microssatélites e SNPs, o poder informativo de dinucleotídeos (os mais informativo entre os microssatélites) foi de cinco a oito vezes maior do que SNPs. Entretanto observou-se que entre 2 e 12% dos SNPs possuem um poder informativo maior do que a média dos dinucleotídeos (ROSENBERG et al., 2003).

O teste de alocação pode ser utilizado em genética da conservação pela identificação da população de origem de indivíduos de determinada espécie, sendo uma ferramenta útil para a conservação de espécies ameaçadas de extinção, alvo de contrabando e biopirataria (MANEL, BERTHIER e LUIKART, 2002). Além disso, o teste de alocação pode ser utilizado também como uma ferramenta dentro do contexto dos programas de melhoramento genético.

No caso do eucalipto, um gênero com grande facilidade de hibridização entre diferentes espécies, nos primeiros programas de melhoramento no Brasil não havia um controle efetivo dos cruzamentos. Dessa forma, genótipos superiores foram desenvolvidos sem que se soubesse com precisão a constituição genética dessas árvores, nem as espécies que faziam parte desses híbridos (FONSECA et al., 2010). O teste de alocação, realizado com base em marcadores moleculares, pode fornecer com grande precisão a constituição genética de clones superiores e as espécies presentes nos mesmos. Esse teste também pode potencialmente inferir a origem de produtos dos quais é possível a obtenção de DNA (ex. madeira,) do ponto de vista de espécie, população ou mesmo clone, o que auxiliaria, por exemplo, na investigação de contrabando e pirataria de produtos vegetais. Faria (2008) alocou 54 clones de Eucalyptus de domínio público utilizados em programas de melhoramento utilizando uma bateria de 35 microssatélites. Resultados consistentes com o histórico de hibridação conhecido para estes clones foram obtidos. O sistema de alocação desenvolvido com base em microssatélites, embora permita alocar clones corretamente com elevadas probabilidades às suas espécies originais, ainda apresenta problemas. A presença de alelos não amostrados no banco de dados, a presença de alelos nulos não detectados e a não aderência ao equilíbrio de Hardy-Weinberg pode influenciar sobremaneira as probabilidades de alocação. O desenvolvimento de um painel de marcadores SNPs bialélicos com

alto poder informativo para detecção de ancestralidade pode ser útil para compor um sistema de alocação de clones de Eucalyptus com maior precisão e acurácia.

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL:

Avaliar comparativamente o poder de resolução de diferentes conjuntos de marcadores moleculares (microssatélites baseados em di- e trinucleotídeos, microssatélites baseados em tetra, penta- e hexanucleotídeos e SNPs) para múltiplas aplicações no melhoramento de Eucalyptus. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Avaliar o poder informativo de três conjuntos de marcadores moleculares para fins de identificação individual e estudos de parentesco em cada uma de seis espécies de Eucalyptus.

Propor um multiplex com elevado poder informativo para estudos de parentesco para microssatélites baseados em di- e trinucleotídeos e para microssatélites baseados em tetra-, penta- e hexanucleotídeos.

Identificar, selecionar e propor um painel de SNPs que apresente elevado conteúdo informativo para identificação individual e estudos de parentesco nas seis espécies simultaneamente.

Identificar, selecionar e propor um painel de SNPs com elevado poder informativo para estudos de ancestralidade, detecção de estrutura genética e alocação de híbridos às respectivas espécies componentes.

Avaliar comparativamente o poder de resolução de quatro conjuntos de marcadores moleculares para fins de detecção de estrutura genética de populações naturais e alocação de híbridos às espécies componentes.

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 MATERIAL GENÉTICO

Foram utilizadas amostras de indivíduos geneticamente não relacionados pertencentes a seis diferentes espécies do gênero Eucalyptus. Dentre as espécies utilizadas, destacam-se as cinco espécies mais utilizadas comercialmente, todas pertencentes ao subgênero Symphomyrtus, porém de seções taxonômicas distintas: E. grandis (seção Latoangulatae), E. urophylla (seção Latoangulatae), E. globulus (seção Maidenaria), E. nitens (seção Maidenaria) e E. camaldulensis (seção Exsertaria). Adicionalmente, indivíduos da espécie E. dunnii, também pertencente ao subgênero Symphomyrtus - Maidenaria, foram analisados. O material genético das seis espécies de eucalipto foi fornecido por diferentes empresas e são originalmente provenientes de coletas realizadas na Australia em procedências (localidades) específicas.

Os indivíduos foram genotipados com dois diferentes tipos de marcadores moleculares (microssatélites e SNPs), no entanto nem todos os indivíduos foram analisados com os dois sistemas de genotipagem. No total foram estudados 117 indivíduos, sendo 112 genotipados com marcadores microssatélites e 108 com marcadores SNPs. Para as seis espécies utilizadas, a procedência, a latitude, o número de indivíduos para cada procedência e o número de indivíduos utilizados em cada sistema de genotipagem estão apresentadas na Tabela 1.

Tabela 1: Espécie, procedência, latitude, número de indivíduos para cada procedência e número de indivíduos analisados com cada sistema de genotipagem.

Espécie Procedência Latitude Nº de indivíduos SSR SNP

E. grandis Atherton 17°15′S 145°28′E 12 12 12

E. grandis Coffs Harbor 30°18′S 153°07′E 12 12 12 E. urophylla Flores Island 8°39′S 122°15′E 16 16 16

E. globulus Jeeralang 38°24'S 146°28'E 12 12 12

E. globulus Flinders Island 40°00′S 148°07′E 12 12 12 E. nitens Eastern Ebor 30°24′S 152°29′E 16 16 16 E. camaldulensis Walsh River 17°17′S 144°88′E 21 16 16

E. Dunnii ND ND 16 16 8

ND – Não disponível

Para os estudos de alocação foram utilizados 24 indivíduos pertencentes a duas famílias de irmãos completos, sendo uma família (IP) oriunda de um cruzamento entre espécies puras (E.

grandis X E. urophylla) e outra família (DGxUGL) oriunda de um cruzamento entre híbridos (E. dunnii e E. grandis X E. urophylla e E. globulus). Para cada família dez indivíduos da progênie e

seus respectivos parentais foram estudados. Todas as amostras pertencentes às duas famílias foram genotipadas com ambos os tipos de marcadores.