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Um outro parâmetro físico químico caracterizado foi o potencial zeta ( ζ ). O potencial ζ foi utilizado com o objetivo de detectar alterações na carga superficial das partículas devido à adição da ftalocianina às nanoestruturas. Para todas as formulações de NC, foram observados valores negativos de potencial ζ. Esse potencial negativo é provavelmente decorrente da ionização de grupos carboxílicos presentes no polímero, os quais se dissociam no meio aquoso e também devido à lecitina utilizada nas formulações.

As pequenas variações nos valores de potencial ζ para as NC de PLA (PM=

42kDa) sugerem que a superfície das nanocápsulas com AlClPc tem a mesma composição das NC brancas, ou seja, nessa condição parece que a maior parte do fármaco encontra se encapsulado no núcleo oleoso, sem influenciar significativamente na interface (Figura 22 e Tabela 7).

Para as NC de PLA PEG, entretanto, a adição de AlClPc às NC levou a grandes

reduções nos valores absolutos de potencial ζ,sugerindo que, nessa formulação, a

ftalocianina encontra se associada a superfície da parede polimérica (Figura 22 e Tabela 7). A redução significativa dos valores absolutos do potencial zeta das NC de PLA PEG, com a inclusão crescente de AlClPc nas formulações, reforça a hipótese de interação ftalocianina e PLA PEG (Tabela 7). A associação do AlClPc à parede polimérica da NC de PLA PEG pode ser observada, também, pela diminuição da porcentagem de fármaco precipitado na formulação contendo 0,2mg/mL (Tabela 5) em conseqüência da redução do tamanho dessas nanoestruturas, uma vez que quanto menor o diâmetro das NC, maior a área de superfície para interação da ftalocianina. Conforme apresentado na tabela 8, a variação na quantidade de etanol presente na fase orgânica durante a preparação das NC não influenciou na carga de superfície das NC de PLA e

PLGA. Alterando os valores de potencial ζsomente das formulações de PLA PEG

Figura 22: Alterações no potencial zeta ( ζ ) de ;C de mesma concentração (0,1mg/mL), mas preparadas com diferentes % de etanol na fase orgânica. Resultados expressos como média + DP (n=3). * Diferença significativa (p<0,05).

2. A ÁLISE MORFOLÓGICA DAS A OPARTÍCULAS

As NP foram observadas quanto a sua forma, tamanho e organização estrutural por Microscopia de Força Atômica (MFA). A MFA é uma técnica poderosa para

obtenção de imagens em escala nanométrica com alta resolução (Neves et al., 1998).

Foram analisadas formulações de NC e NS vazias e contendo AlClPc em diferentes concentrações. Como superfícies de deposição para as amostras de NC foram utilizadas as superfícies da mica e da lâmina de vidro. As lâminas de vidro foram bem lavadas e a mica clivada no momento do uso para garantir a limpeza do material de deposição. Todas as formulações obtidas de NS e NC apresentaram se esféricas e com a superfície regular (Figuras 23, 24A e 24B).

465 455 445 435 425 415 45

NC PLA 42000 NC PLGA NC PLA4PEG

Va lo re s d e Po te n c ia l Z e ta d e N C c o m 0 ,1 m g /m L d e A lC lPc 50% etanol 70% etanol *

A B

A B

Figura 23: Imagem de altura (A) e fase (B) de um agrupamento de ;S de PLA contendo o AlClPc. As ;S foram depositadas na superfície da mica. Área: 8µm x 8µm

A

A _BB

A

A _BB

Figure 24: Imagem tridimensional por Microscopia de Força Atômica: ;C de PLA (A), ;C de PLA PEG ;C (B) com 0,2mg/mL de AlClPc. As ;C foram depositadas na superfície da mica. Área: 5µm x 5µm

Para as NC, analisadas em duas superfícies de deposição, as características de esfericidade e superfície regular foram mantidas, independentemente do material utilizado para deposição das amostras (Figuras 25 e 26).

Figura 25: Imagem de altura (A) e imagem tridimensional (B) de ;C de PLA contendo 0,2mg/mL de AlClPc, depositadas sobre a superfície da mica. Área: 3µm x 3µm.

Figura 26: Imagem de altura (A) e imagem tridimensional (B) de ;C de PLA contendo 0,05mg/mL de AlClPc, depositadas sobre a superfície da lâmina de vidro. Área: 3µm x3µm

A MFA foi utilizada também para determinação do tamanho das nanoestruturas como mostrado na figura 27. Os valores de tamanho obtidos foram comparados com os determinados por espectroscopia de correlação de fótons (PCS) e, também, utilizados para determinação da relação diâmetro/altura.

Figure 27: Medida de diâmetro e altura por Microscopia de Força Atômica de ;C de PLA PEG depositadas sobre a superfície da lâmina de vidro. Área: 3µm x 3µm

O tamanho das NC de PLA vazias obtido por MFA na superfície da mica variou de 117 a 546nm, apresentando uma distribuição heterogênea de partículas na formulação. O tamanho médio dessa mesma amostra determinado por PCS foi 249,7 + 2,0nm (Tabela 9). Essa diferença entre as medidas de tamanho pode ser percebida em todas as formulações de NC. Isso ocorre devido a uma possível agregação das NC na superfície de deposição ou devido ao achatamento dessas estruturas quando depositadas sobre a superfície da mica, como observado por Leiteet al., 2005.

Para as NC de PLA e PLA PEG, vazias e contendo 0,2mg/mL de AlClPc, a média da relação diâmetro/altura determinada por MFA na superfície da mica foi 9,5 ± 1,7 (Tabela 9). Esses dados sugerem a existência de formas achatadas, provavelmente devido à estrutura interna das NC ser constituída de óleo e ser envolvida por uma membrana polimérica flexível. Para as NS, a relação diâmetro/altura foi próxima de 1 (Tabela 9), demonstrando que o fenômeno de achatamento não ocorre nessas estruturas (Figura 28). Observa se que o achatamento na superfície da mica é maior que na superfície do vidro. Provavelmente, as nanopartículas possuem uma superfície com

maior afinidade pela mica do que pelo vidro, o que implica no maior achatamento (Tabela 9). Por MFA o tamanho das NC foi sempre superior ao das NS, o que pode ser devido tanto ao achatamento das NC, quanto a formação real de nanoestruturas com matriz polimérica menores e menos complexas, no caso das NS. Este fato, já foi

amplamente observado por outros autores (Mosqueira et al., 2000). Esses resultados

encontram se de acordo com estudos anteriores (Montasser et al., 2002; Leite et al., 2005), mostrando que as NC, diferentemente das NS que apresentam uma estrutura rígida, podem se deformar facilitando sua transposição por espaços intercelulares, in vivo (Leite et al., 2005), devido o endotélio mais permeável e poroso encontrado em certos tipos de tumores ( Konanet al., 2002 e Pereiraet al.,2008) (Figura 28).

Tabela 8: Diâmetro médio de ;P determinado por MFA na superfície da mica e a relação diâmetro/ altura de ;P vazias e contendo AlClPc (0,2mg/mL) depositadas sobre superfície da lâmina de vidro e da mica

.

Formulações de anopartículasa

AlClPc (mg/ml)

Diâmetro Médio das Partículas + DPb(nm)

por MFA (mica)

Relação Diâmetro/ Altura

Mica Vidro

NC de PLA branca 265,3 ± 37,5 8 4

NC de PLA 0,2 211,8 ± 31,4 11 6

NC de PLA PEG branca 270,7 ± 68,3 11 7

NC de PLA PEG 0,2 153,5 ± 49,9 8 5

NS de PLA 0,2 98,0 ± 25,2 1,5 nd

a

Formulações de nanocápsulas de ácido poli (D,Lácido lático) (PM = 42,5kDa) (NC de PLA) e nanocápsulas de PLA com cadeias de polietilenoglicol ligadas à superfície (NC de PLA PEG), ambas vazias ou contendo 0,2mg/mL de AlClPc e formulação de nanoesfera de ácido poli (D,L ácido lático) (PM = 42000) contendo 0,2mg/mL de AlClPc. bDesvio Padrão (n=3); nd = não determinado.

Figura 28: Representação esquemática do achatamento das ;C, sobre a superfície de deposição, comparado a rigidez da matriz polimérica das nanoesferas

A obtenção de imagem das NC sobre a lâmina de vidro foi mais difícil e demorada que na superfície da mica, devido a um maior arraste dessas nanoestruturas pela sonda de varredura utilizada. Entretanto, na lâmina de vidro as NC apresentaram se menos achatadas, ou seja, apresentaram uma menor relação diâmetro/ altura (Tabela 9), provavelmente, resultante de uma menor afinidade com este material.

As NC foram observadas também sobre a superfície de hemácias (Figura 29 A e B). Embora a solução das NC provocasse a lise das hemácias pela presença de meio externo hipotônico, esta superfície celular se revelou muito interessante para observação das nanoestruturas (Figura 29 C e D). Foi possível observar que as NC mantiveram sua forma esférica e regular sem, entretanto, apresentarem se achatadas como ocorre quando são depositadas na superfície da mica. Estão sendo atualmente realizados novos estudos para adequação desta metodologia de interação entre as NP e as superfícies celulares por AFM. Quando depositadas sobre as hemácias, as NC apresentaram uma relação diâmetro/altura de aproximadamente 2,5 (Figura 29, E e F). Isso demonstra, mais uma vez, que a superfície escolhida para a deposição das amostras de NP influencia na realização das imagens por MFA e, também, na determinação do tamanho dessas nanoestruturas por essa técnica.

Figura 29: Imagem de altura (A) e imagem de amplitude (B) do esfregaço sanguíneo em lâmina de vidro. Área: 25µm x 25µm, (C) e (D) após adição de formulação de ;C de PLA contendo AlClPc (0,2mg/mL). Área: 30µm x30µm; e (E) e (F) ampliação de (C) e (D), respectivamente. Área: 5µm x5µm

Não foram observadas diferenças entre as NC e NS, carregadas ou não com o AlClPc. A não ocorrência de alteração significativa da superfície dessas partículas em nível nanométrico é indicativa da encapsulação do FS no núcleo oleoso das NC ou na matriz polimérica das NS. Os valores de % de encapsulação encontrados reforçam essa hipótese.

As imagens obtidas por AFM sobre a superfície das hemácias abrem uma boa perspectiva de trabalho no campo das interações entre NP e células. Como observado ao longo deste trabalho, interações seletivas com determinado tipo celular foram observadas (neutrófilos) em detrimento de outras células (linfócitos), sendo que essa

ferramenta de observação física possibilitará também, num futuro próximo, visualizar a interação com outros tipos celularesin vitro.