As diferentes amostras analisadas foram identificadas do seguinte modo (Tabela 8):
Tabela 8 – Identificação das amostras analisadas
Codificação Tipo de amostra Região Ano
A1-A6 Mosto de vinho branco de em diversas
fases de fermentação Bucelas
2005 (Vindima)
B Vinho branco D.O.C. Bucelas 2004
C Vinho tinto D.O.C. Estremadura 2003 D Vinho de mesa tinto comercial n.º 1 n.a.
E Vinho de mesa branco comercial n.º 1 n.a. F Vinho branco D.O.C. resultante dos
mostos A1-A6 Bucelas 2005
G Vinho licoroso comercial Douro n.a. H Vinho tinto Regional Beira Interior 1999
I Vinho tinto D.O.C Setúbal 1998
J Vinho tinto Regional Estremadura 2002 K Vinho branco Regional Estremadura 2002
L Vinho licoroso D.O.C. Setúbal 2002
M Vinho de mesa branco comercial n.º 2 n.a.
N Vinho tinto D.O.C Beira Interior 2000 O Vinho tinto Regional Estremadura 1999 P Vinho de mesa tinto comercial nº2 Douro n.a. n.a. – não aplicável – na rotulagem dos vinhos de mesa geralmente não é indicada a região de origem nem o ano de produção.
- As amostras A1 a A6 foram recolhidas durante a vindima de 2005 junto do produtor, sendo congeladas a -18ºC imediatamente após a sua recolha até ao momento de análise.
- As amostras D, E e G foram adquiridas em grandes superfícies no Distrito de Lisboa.
- A amostra L foi cedida pelo Laboratório de Química do Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica / Instituto de Tecnologia Química e Biológica.
- As restantes amostras de vinho foram adquiridas em loja própria do produtor.
- Todas as amostras de vinhos analisadas foram obtidas a partir de produtos já engarrafados ou embalados, nas mesmas condições de venda ao público em geral.
24
3. Resultados e discussão
3.1 Análise por cromatografia gasosa / espectroscopia de massa
3.1.1 Cromatograma e espectro de massa do carbamato de etilo
Quando analisado nas condições de GC/MS definidas em 2.5.1, utilizando uma coluna do tipo carbowax, o carbamato de etilo apresentou um tempo de retenção de 23,34 minutos (Figura 3):
Figura 3 – Cromatograma de padrão de CE a 1000 ppb. Análise em modo SCAN
O composto, ao ser sujeito a ionização por impacto electrónico apresentou o seguinte espectro de massa (Figura 4):
Figura 4 – Espectro de massa do CE obtido pela análise de padrão a 1000 ppb em modo SCAN
Da análise do espectro obtido (Figura 4) e das respectivas intensidades das massas (Apêndice 2) é possível verificar que aquelas que apresentaram uma maior intensidade relativa foram, por ordem decrescente, as massas 44, 62, 45, 31, 74, 43 e 46. A massa 89 corresponde ao ião molecular do composto. Os fragmentos correspondentes a algumas das massas mais abundantes no espectro do são respectivamente:
- m/z 44 – (NH2CO) +
- m/z 45 – (C2H5O)+
- m/z 74 – (M-CH3●)+
- m/z 62 – (M-C2H3●)+
A massa 62 resulta de uma reacção de rearranjo “McLafferty +1” (Figura 5). Os índices de semelhança obtidos pela comparação destes espectros com os existentes nas bibliotecas do equipamento (Apêndice 2) foram, para esta ordem de concentrações, iguais ou superiores a 95 %.
25 Figura 5 – Reacção “McLafferty +1” para o carbamato de etilo
A selecção dos iões para efeitos de identificação e quantificação do CE coloca alguns problemas. O ião molecular do composto corresponde ao fragmento m/z 89. Este apresentou, para esta ordem de concentrações uma intensidade relativa muito baixa de 10,67 %. Portanto, à medida que a concentração de CE ensaiada fosse diminuída, e tendo em conta os valores das concentrações de CE que seria expectável encontrar nos vinhos a analisar – poucos ppb’s – seria difícil a obtenção de uma resposta satisfatória deste ião, para a gama mais baixa de concentrações ensaiada. A obtenção de baixas respostas para a massa 89 foi confirmada quando foi efectuada a curva de calibração do composto (dados apresentados na página 33). Este aspecto é referido no Método Oficial, que indica que a para a obtenção de uma resposta satisfatória para esta massa, poderá ser necessário efectuar reconcentrações dos extractos das amostras.
Os fragmentos 44 e 74 apresentam frequentemente interferências da matriz, mesmo quando são utilizadas técnicas de cromatografia multidimensional. Também foi reportada a presença de compostos interferentes em vinhos para as massas 27, 29, 31, e 45. A massa 74 é comum a todos os ésteres alquil metílicos. Os fragmentos 44 e 45 são ainda susceptíveis a interferências causadas pela presença do anidrido carbónico [79,81,85,89,91,93,112,116,117,132].
Desta forma, resta o fragmento 62 como o mais adequado para efeitos de quantificação do composto. De facto em todas as referências para métodos de análise do composto é referida a utilização desta massa para esse fim. [33,44,69,73,77,86,88,90,94,95,116-119,131]
No entanto, de acordo com os critérios definidos no Método Oficial [95], será necessário que sejam efectuadas duas razões de intensidades, entre as massas 62 e 74, e entre as massas 62 e 89. Também de acordo com Método Oficial estas razões não deverão divergir mais de 20 % entre padrões e
26 amostras, de forma a ser possível a identificação do CE. Como limite de quantificação são indicados no Método Oficial 10 ppb.
As razões das áreas das massas calculadas nos padrões de CE ensaiados, com concentrações na ordem dos 1000 ppb, foram respectivamente de 6,1 para a relação 62/74 e de 56,2 para a relação 62/89. Aplicando a percentagem de variação admitida no Método Oficial (20%) obtiveram-se os valores de 6,1±1,2 para a relação 62/74 e de 56,2±11,2 para a relação 62/89.
Para se poder efectuar uma identificação do CE nas amostras de vinhos, de acordo com os critérios do Método, as razões das massas calculadas a partir dos espectros de massa obtidos, necessitavam de estar compreendidas nestes intervalos.
Como não existem valores de referência para estas relações, é necessário que estas sejam calculadas previamente à análise de amostras em cada laboratório que pretenda efectuar uma identificação do CE.
3.1.2 Escolha do tipo de coluna para a realização dos ensaios
Na fase inicial dos trabalhos foram efectuadas algumas determinações com uma coluna do tipo DB-5. Utilizando esta coluna o CE apresentou, nas condições descritas em 2.6.1 um tempo de retenção de 6,45 minutos (Figura 6).
Figura 6 – Cromatograma de padrão de CE a 1 ppm. Análise em modo SCAN
Após a análise de amostras em modo SCAN foi possível concluir que existiam compostos sobrepostos ao CE que apresentam massas comuns a este (Figuras 7 e 8), nomeadamente as massas 62, 74 e 89 que, como anteriormente indicado, são as mais importantes para a identificação do composto. A
sobreposição de compostos com massas comuns ocorreu com a utilização dos métodos de pré-tratamento por SPE e por MEFS. Não foram efectuadas determinações com esta coluna utilizando
o método de pré-tratamento por QuEChERS. Carbamato de etilo
27 Figura 7 - Cromatograma de amostra B com pré-tratamento por SPME. Análise em modo SCAN
Os compostos sobrepostos foram identificados como sendo acetato de isoamilo (Apêndice 3 – Secção 1), e hexanol com um índice de semelhança de 96 e 97 %, no caso das amostras de vinho, respectivamente (Figura 7) e hexenal, hexanol e octanol (Apêndice 3 – Secção 2,3 e 4, respectivamente), com índices de semelhança de 97, 91 e 88 % no caso das amostras de mostos, respectivamente (Figura 8).
Figura 8 - Cromatograma de amostra A4 com pré-tratamento por SPE. Análise em modo SCAN
Como forma adicional de confirmação da identidade dos compostos sobrepostos foram verificados os índices de Kovats indicados na literatura para o tipo de coluna utilizado (DB-5) [137]. Os valores reportados na literatura são de 838,5 para o hexenal (média de 4 valores), 876 para o acetato de isoamilo (1 valor), 883,6 para o hexanol (média de 5 valores) e 1012 para o octanol (média de 3 valores). A ordem de saída verificada nos cromatogramas é concordante com os índices de retenção consultados, excepto para o acetato de isoamilo, que foi eluído depois do hexanol no caso das amostras de vinhos (Figura 7). No entanto os valores para ambos os compostos são bastantes próximos entre si, e apenas foi considerado 1 valor para o acetato de isoamilo.
Foi ainda efectuada a análise em modo SCAN de amostras fortificadas com CE (Figura 9). Os resultados obtidos confirmaram a sobreposição deste às substâncias anteriormente indicadas.
Acetato de isoamilo Hexenal Hexanol Octanol Massa 62 Massa 74 Massa 89 Massa 62 Massa 74 Hexanol
28 Figura 9 - Cromatogama de amostra A3 fortificada a 1 ppm com CE com pré-tratamento por SPME. Análise em
modo SCAN
Desta forma concluiu-se que a coluna DB-5 não permitia a identificação do CE nas amostras analisadas. O revestimento desta coluna é constituído por difenildimetilpolisiloxano que é menos polar que a coluna do tipo carbowax, cujo revestimento é constituído por polietilenoglicol. Em todas as determinações posteriormente efectuadas por GC/MS foi utilizada uma coluna de carbowax.
3.1.2 Especificidade do método / presença de interferências
São de seguida apresentados os resultados obtidos na análise de amostras com as 3 técnicas de pré-tratamento anteriormente indicadas e posterior análise por GC/MS. Uma vez que o CE apresentou um tempo de retenção de aproximadamente 23,34 minutos nos ensaios com padrões, os resultados de seguida indicados (Figuras 10 a 12) reportam-se ao intervalo compreendido ente os 23 e os 24 minutos.
Em todas as amostras de vinhos analisadas foi detectada a presença de 2 compostos, o ácido butanodioico e o 3-(Metiltio) propan-1-ol, ambos com índices de semelhança superiores a 93 %. Ambos os compostos são característicos dos vinhos [136]. Analisando os espectros de massa obtidos para cada um deles (Apêndice 3 – Secção 5 e 6, respectivamente) observa-se que o ácido butanodioico apresenta a massa 74 comum com o CE e que o 3-(Metiltio) propan-1-ol apresenta a massa 62 comum com o CE. No entanto, uma vez que os tempos de retenção obtidos para cada um deles foram em média de 22,93 e 24,05 minutos, respectivamente considerou-se que a sua presença não constituiria uma fonte de interferência para a análise do CE.
Foram também detectados outros picos com tempos de retenção mais próximos aos do CE, com 23,12
e 23,25 minutos, respectivamente. Estes compostos foram identificados como o decenoato de etilo e o α-terpineol. Estes compostos são também característicos dos vinhos [135].
Devido ao facto dos picos detectados para estes compostos se encontrarem parcialmente sobrepostos, os índices de semelhança obtidos foram inferiores, estando compreendidos entre os 73 e os 85 %, respectivamente. Considerou-se que estes índices de semelhança não eram suficientes para
Pico de massa 62 resultante da fortificação com CE a 1000 ppb
29 se efectuar uma identificação dos compostos. Como forma adicional de confirmação da identidade dos compostos foram verificados os respectivos índices de Kovats, para o tipo de coluna utilizado (carbowax) [135]. Os valores consultados foram de 1702 para o ácido butanodioico, 1708 para o decenoato de etilo, 1716 para o α-terpineol e de 2209 para o 3-(Metiltio) propan-1ol. Estes valores são concordantes com a ordem de saída observada nos cromatogramas das amostras.
Analisado o espectro de massa do decenoato de etilo (Apêndice 3 – Secção 7) verificou-se que este também apresenta a massa 74. Relativamente ao α-terpineol, uma vez que se dispunha do respectivo padrão, este foi também analisado para se verificar qual o espectro de massa obtido no equipamento utilizado (Apêndice 4). Esta análise permitiu confirmar a proximidade do tempo de retenção do composto relativamente ao tempo do CE, mas também permitiu verificar no respectivo espectro a ausência das 3 massas mais importantes para a identificação do CE (massas 62, 74 e 89).
Figura 10 – Cromatograma de amostra C com pré-tratamento por SPME. Análise em modo SCAN
Figura 11 – Cromatograma de amostra E com pré-tratamento por SPE. Análise em modo SCAN
No caso do método QuEChERS verificou-se que a sua utilização resultava na obtenção de cromatogramas que só apresentavam um pico aos 23,15 minutos (Figura 12), detectado em todas as amostras de vinho submetidas a este pré-tratamento, cujo espectro de massa (Figura 13) não teve correspondência com nenhum composto listado nas bibliotecas de massas disponíveis no equipamento. a) a) b) b) c),d) c),d)
30 Figura 12 – Cromatograma de amostra D com pré-tratamento por QuEChERS. Análise em modo SCAN
Legenda das Figuras 10 a 12: a) Ácido butanodioico; b) 3-(Metiltio) propan-1-ol;
c) Decenoato de etilo; d) α-terpineol;
e) Composto não identificado.
Figura 13 - Espectro de massa do composto não identificado em modo SCAN
Em resumo, nas amostras analisadas não se observaram compostos com o mesmo tempo de retenção do CE, apesar de terem sido observados compostos com tempos próximos e com massas comuns ao composto. Foi confirmado que estes compostos não eram CE.
Foram observados no entanto outros fenómenos de interferência a nível da análise do CE quando foi utilizada a GC/MS. Em 75 % das 174 determinações efectuadas em amostras utilizando esta técnica, foi detectada, independentemente do tipo de pré-tratamento da amostra utilizado e do tipo de amostra analisado, a presença de um pico de massa 74 (Figuras 14 e 15) numa zona dos cromatogramas que o sobrepunha ao tempo de retenção do CE.
Figura 14 – Representação da zona de interferência causada por pico de massa 74 em amostra B com pré-tratamento por SPME. Análise em modo SCAN
a) b) Pico de interferência de massa 74 e)
31 Figura 15 - Representação da zona de interferência causada por pico de massa 74 em amostra E com
pré-tratamento por SPE. Análise em modo SCAN
A altura máxima do pico registado não teve uma correspondência directa com nenhum dos picos registados nos cromatogramas em modo SCAN (Figuras 14 e 15). Desta forma não foi possível atribuir a sua origem a um composto em particular presente nas amostras. Este pico foi detectado em tempos diferentes nos vários cromatogramas. No exemplo dado na Figura 14, este pico foi detectado aos 22,90 minutos, enquanto que na Figura 15 este pico foi detectado aos 23,25 minutos.
Para verificar se esta variação nos tempos estaria relacionada com as intensidades registadas para o pico, foi efectuada uma integração de todos os picos de interferência nos cromatogramas em que foram detectados. Não foi possível estabelecer nenhuma correlação clara entre os dois conjuntos de valores.
Foi também colocada a hipótese deste pico ter origem em compostos que pudessem ficar retidos na coluna entre determinações, uma vez que a temperatura máxima de trabalho na coluna não ultrapassou os 220ºC. Contudo, em nenhum dos nos ensaios em branco das colunas, repetidos em duplicado e em triplicado efectuados quer no início, quer no fim das séries de determinações de amostras e padrões, foi registado um pico de massa 74, que se sobrepusesse ao tempo de retenção do CE (23,34 minutos).
Também nos ensaios em branco efectuados quer com as fibras, quer com os solventes utilizados, não foi detectada a presença de um pico deste tipo. Como já anteriormente referido na página 25, a literatura refere a ocorrência de alguns efeitos de matriz associados à massa 74, pelo que supõe que este pico provavelmente tivesse origem em algum constituinte ou constituintes dos vinhos, mas à luz dos elementos disponíveis não foi possível esclarecer de forma mais clara a sua origem.
A presença deste pico interferente impossibilitou a determinação das relações das intensidades das áreas das massas (neste caso a relação entre as massas 62 e 74) que, conjuntamente com o tempo de retenção observado, permitiram uma identificação inequívoca do CE nas amostras de vinho. Este conclusão é exemplificada na Figura 16, em que é apresentado o cromatograma obtido em modo SIM de uma amostra de vinho fortificada a 60 ppb com CE.
Pico de interferência de massa 74
32 Figura 16 – Representação da zona de interferência causada por pico de massa 74em amostra B com pré-
tratamento por SPE e fortificação a 60 ppb de CE. Análise em modo SIM
A razão 62/74 anteriormente calculada para as respectivas intensidades das massas foi de 6,1 em determinações efectuadas com padrões, conforme indicado na página 26. Analisando a Figura 16, observa-se que a massa 74 tem uma intensidade superior à massa 62. Desta forma não é possível cumprir os critérios estabelecidos do Método Oficial para a identificação do CE. Também não é possível cumprir os critérios estabelecidos para a outra relação de massas (62/89) mencionada no Método Oficial, uma vez que não foi possível obter respostas satisfatórias para a massa 89 (3.1.4), para a ordem grandeza de concentrações de interesse nos vinhos, ou seja, para uma concentração de CE de 30 ppb, que representa o limite legal/voluntário em vigor em alguns países.
3.1.3 Método Oficial modificado
A presença do pico de interferência da massa 74 nos cromatogramas obtidos com as amostras, levou a que fossem ensaiadas diversas modificações ao Método Oficial, na tentativa de eliminar ou reduzir ao máximo a sua influência na determinação do CE. Estas alterações consistiram na modificação da diluição das amostras antes da colocação na coluna de SPE, na alteração dos tempos de contacto da amostra antes da eluição, na alteração dos volumes de diclorometano utilizados, e na utilização de várias colunas em série.
Algumas das modificações ensaiadas, descritas em 2.4.2.2, tendo por base o Procedimiento Normalizado de Trabajo (PNT) utilizado em Espanha no laboratório de controlo oficial de alimentos [10, 15, 123], permitiram a obtenção de cromatogramas (Figura 17) com um menor número de picos na zona de interesse para a pesquisa do CE.
Pico de massa 62 resultante da fortificação com CE Pico de interferência da massa 74
33 Figura 17 - Comparação de cromatogramas da amostra E obtidos com o Método Oficial e com o Método Oficial
modificado. Análise em modo SCAN
Não obstante, continuou a verificar-se a presença da zona de interferência anteriormente descrita. Considerou-se contudo que a utilização do método modificado poderia facilitar a identificação do CE nas amostras, pelo que este foi preferencialmente utilizado face ao Método Oficial.
3.1.4 Resposta de padrões de CE a várias concentrações, estudo da linearidade e de limites de detecção e quantificação e escolha de padrão interno
Foi estudada a linearidade das respostas obtidas para padrões de CE em solução aquosa com as seguintes concentrações: 1, 5, 10, 25 e 50 ppb, uma vez que esta gama abrangia os limites legais para a maioria das amostras a analisar, ou seja vinhos de mesa, cujo limite legal é 30 ppb. Com os resultados obtidos na análise dos padrões em triplicado (Apêndice 5 – Secção 1), construiu-se uma curva de calibração para as massas 62, 74 e 89 (Figura 18). Estas determinações foram efectuadas sem a utilização de padrão interno, apesar de também ser ter estudado a possibilidade da utilização do isoctano para esta função (resultados apresentados na página 36).
y = 86,693x + 20,386 R2 = 0,9903 y = 462x + 626,3 R2 = 0,9957 y = 7,6966x + 21,374 R2 = 0,5563 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 0 10 20 30 40 50 Concentração (ppb) Á re a s Massa 62 Massa 74 Massa 89
Figura 18 - Curva de calibração obtida com padrões de CE. Determinações em triplicado em modo SIM Para os padrões com uma concentração de 1 ppb não foram obtidos sinais para a massa 89. Para uma concentração de 5 ppb também não foi possível a obtenção de sinais para todos os padrões ensaiados.
Método Oficial
34 Através do software disponível no equipamento, utilizando o método RMS (Root Mean Square) foram calculadas as seguintes relações sinal-ruído (S/N):
Tabela 9 - Relações sinal-ruído (S/N) obtidas pelo método RMS na análise de padrões de CE com concentrações ente 1-50 ppb. Média de determinações em triplicado. Determinações em modo SIM
Concentração de CE (ppb) S/N para massa 62 S/N para massa 74 S/N para massa 89
1 38,13 22,49 -
5 - - 3,70
10 - - 4,40
25 - - 5,89
50 - - 25,82
Uma vez que esta forma de cálculo da relação S/N, apesar de automatizada no equipamento utilizado, tende a sobre estimar a relação obtida em aproximadamente 5 vezes [96] foi também efectuado um cálculo manual da relação S/N obtida, através do método peak-to-peak exportando os valores numéricos dos cromatogramas obtidos e efectuando os respectivos cálculos (Tabela 10 / Apêndice 5 – Secção 2).
Tabela 10 - Relações sinal-ruído (S/N) obtidas pelo método peak to peak na análise de padrões de CE com concentrações ente 1-50 ppb. Média de determinações em triplicado. Determinações em modo SIM
Concentração de CE (ppb) S/N para massa 62 S/N para massa 74 S/N para massa 89
1 7,46 1,56 0,79
5 10,69 1,65 1,00
10 18,89 2,46 1,00
25 70,02 8,72 1,33
50 86,36 11,49 1,82
Também foi calculada a relação S/N através do método peak-to-peak, com segmentação do intervalo considerado (Tabela 11 / Apêndice 5 – Secção 3).
Tabela 11 - Relações sinal-ruído (S/N) obtidas pelo método peak to peak segmentado na análise de padrões de CE com concentrações ente 1-50 ppb. Média de determinações em triplicado. Determinações em modo SIM.
Concentração de CE (ppb) S/N para massa 62 S/N para massa 74 S/N para massa 89
1 8,81 1,74 1,28
5 12,51 2,23 1,26
10 23,94 3,04 1,28
25 87,77 11,74 1,73
50 107,19 15,82 2,28
Consoante o método utilizado para a determinação da relação S/N é possível efectuar uma apreciação distinta dos resultados obtidos. Considerando-se o método RMS foram calculados valores superiores a 3 para as massas 62 e 74 com uma concentração de 1 ppb. No caso da massa 89 foi calculado um valor superior a 3 para uma concentração de 5 ppb.
Utilizando os dois métodos peak to peak, foi calculado um valor superior a 3 para a massa 62, para uma concentração de 1 ppb. No caso da massa 74 foi obtido um valor superior a 3 para 10 ou 25 ppb consoante o método utilizado. No caso da massa 89 não foi calculado um valor superior a 3 para as concentrações de padrões de CE ensaiadas para ambos os métodos utilizados.
35 A partir das respostas obtidas com os padrões de CE nesta gama de concentrações, foram também calculadas as respectivas relações de intensidades das áreas para estas massas. Estes valores foram comparados com as relações anteriormente calculadas para os padrões de CE a 1000 ppb (página 26). No caso da relação 62/74 foram obtidos desvios inferiores a 20 % para toda a gama de concentrações ensaiada. No caso da relação 62/89 apenas foi obtida uma variação inferior a 20 % no caso da concentração mais elevada (Apêndice 5 – Secção 4).
Para cada uma das massas foi estudada a linearidade das respostas obtidas de acordo com as normas