Lokal overvannsdisponering (LOD)

Em 14 dias, a coloração com ARS revelou, para todos os grupos, formações nodulares típicas de matriz mineralizada, castanho-avermelhadas, circundadas por áreas de mineralização difusa, de cor avermelhada, de extensão variável (Figura 17). Quantitativamente, as culturas sobre 4h e 4h+GDF-5 mostraram áreas mais extensas de mineralização em comparação ao Controle, sem diferenças entre os grupos com GDF-5 e seus respectivos controles (Figura 18; Tabelas 8 e 10). No entanto, a extração de ARS permitiu identificar valores estatisticamente maiores para culturas crescidas sobre nanotopografias com GDF-5 em comparação com seus controles, 30’ e 4h. (Figura 19; Tabelas 9 e 10).

Figura 17. Aspecto macroscópico de culturas osteogênicas sobre as diferentes superfícies de Ti, em 14 dias, coradas com ARS, para detecção de acúmulos de cálcio.

Figura 18. Porcentagem de área total corada com ARS em culturas osteogênicas sobre as diferentes superfícies de Ti, em 14 dias. Áreas mais extensas foram observadas para os grupos 4h e 4h+GDF-5, em comparação com Controle.

Resultados | 56

Tabela 8 – Análise de variância a um fator de variação (pós-teste de Tukey) referente à porcentagem de área total corada com ARS em culturas osteogênicas sobre as diferentes superfícies de Ti, em 14 dias. Os grupos experimentais estão indicados por números, de 1 a 5

*p<0,05

Figura 19. Quantificação de ARS (em valores de densidade óptica) de culturas osteogênicas sobre as diferentes superfícies de Ti, em 14 dias. Notem-se valores maiores para os grupos de nanotopografia com GDF-5, comparados com seus respectivos controles.

Tabela 9 – Análise de variância a um fator de variação (pós-teste de Tukey) referente à quantificação de ARS de culturas osteogênicas sobre as diferentes superfícies de Ti, em 14 dias. Os grupos experimentais estão indicados por números, de 1 a 5

*p<0,05 1 Controle 2 30’ 3 30’+GDF-5 4 4h 5 4h+GDF-5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 * 5 * 1 2 3 4 5 1 2 3 * 4 5 * * * 1 Controle 2 30’ 3 30’ + GDF-5 4 4h 5 4h + GDF-5

Resultados | 57

Tabela 10 – Análises quantitativas de adesão e espraiamento celular, proliferação, número total de células, viabilidade celular, expressão gênica, atividade de ALP, áreas de mineralização e extração de ARS de culturas osteogênicas crescidas sobre superfícies de titânio Controle, 30’, 30’+GDF-5, 4h e 4h+GDF-5

Parâmetros Tempo Controle 30’ 30’+GDF-5 4h 4h+GDF-5 P

60,3 ± 7,7 53,2 ± 9,4 73,4 ± 4,5 47,2 ± 4,1 79 + 5,3 < 0,05 Adesão e espraiamento celular (Estágios 1 e 2; 3 e 4; %) 4 h 39,7 ± 7,7 46,8 ± 9,4 26,6 ± 4,5 52,8 ± 4,1 21 ± 5,3 < 0,05 Proliferação (Ki-67; %) 3 d 59 ± 7,6 63,7 ± 10,3 67,8 ± 5,7 63 ± 12,5 62,8 ± 5,2 NS Número total de células 7 d 28 ± 10,3 37,5 ± 2,8 37,5 ± 4,5 41,3 ± 2,7 37 ± 8 < 0,05

1 d 0,048 ± 0,018 0,054 ± 0,009 0,067 ± 0,013 0,036 ± 0,004 0,026 ± 0,012 NS 3 d 0,089 ± 0,035 0,078 ± 0,017 0,073 ± 0,007 0,079 ± 0,012 0,084 ± 0,023 NS Viabilidade celular

7 d 0,262 ± 0,038 0,225 ± 0,032 0,265 ± 0,030 0,26 ± 0,073 0,256 ± 0,026 NS 7 d 1,002 ± 0,077 0,85 ± 0,098 0,823 ± 0,075 1,009 ± 0,041 0,9 ± 0,116 < 0,05 Expressão RNAm de RUNX2

10 d 0,64 ± 0,076 0,445 ± 0,035 0,384 ± 0,01 0,415 ± 0,02 0,238 ± 0,019 < 0,05 7 d 1,002 ± 0,076 0,847 ± 0,046 0,953 ± 0,066 0,953 ± 0,078 0,910 ± 0,149 < 0,05 Expressão RNAm de ALP

10 d 0,827 ± 0,043 0,561 ± 0,046 0,459 ± 0,014 0,516 ± 0,048 0,258 ± 0,02 < 0,05 7 d 1,001 ± 0,065 1,173 ± 0,164 1,11 ± 0,09 1,315 ± 0,2 1,64 ± 0,15 < 0,05 Expressão RNAm de BSP

10 d 2,514 ± 0,21 1,236 ± 0,115 0,787 ± 0,076 0,993 ± 0,084 0,331 ± 0,056 < 0,05 7 d 1,001 ± 0,065 0,726 ± 0,065 0,582 ± 0,034 0,752 ± 0,052 0,862 ± 0,055 < 0,05 Expressão RNAm de OPN

10 d 5,522 ± 0,895 2,353 ± 0,313 0,384 ± 0,01 4,605 ± 0,257 3,065 ± 0,129 < 0,05 7 d 3,3 ± 3,2 4,7 ± 3,2 2,4 ± 0,8 3,6 ± 1,2 2,9 ± 1,3 NS Atividade de ALP 10 d 20,8 ± 7,9 14,3 ± 1,9 21,7 ± 4,4 12,8 ± 2,9 22,6 ± 8,4 < 0,05 Áreas de mineralização 14 d 40 ± 7,9 48,3 ± 3 49,4 ± 2,4 54,6 ± 11,5 54,5 ± 6,4 < 0.05 Extração de ARS 14 d 0,654 ± 0,007 0,59 ± 0,04 0,92 ± 0,078 0,76 ± 0,009 1,181 ± 0,265 < 0,05 NS: Não significante

Discussão | 59

4 DISCUSSÃO:

Os resultados do presente estudo mostraram que a simples adsorção de GDF-5 sobre superfícies de Ti com nanotopografias altera aspectos importantes do processo de aquisição do fenótipo osteogênico in vitro. Menor espraiamento celular

em 4 h e, em 10 dias, redução na expressão de RUNX2, ALP e BSP e aumento da atividade de ALP precederam o aumento de acúmulos de cálcio durante a fase de mineralização de culturas primárias de células osteoblásticas. O tempo de condicionamento de 4h resultou em atividade osteogênica significativamente maior para as culturas expostas ao GDF-5 em comparação ao de 30’.

Diferentes estratégias vêm sendo desenvolvidas com o objetivo de disponibilizar moléculas bioativas na interface biomaterial-tecido biológico para o controle das interações iniciais de células e proteínas plasmáticas e da matriz extracelular com a superfície de implantes (MORRA et al. 2006; MENDONÇA et al. 2008; BEUTNER et al. 2010; RICHERT et al. 2010), o que inclui a funcionalização por simples adsorção ou por ligações covalentes. No presente trabalho, optou-se pelo método de simples adsorção, de menor complexidade e de baixo custo, ainda que potencialmente capaz de produzir efeitos biológicos relevantes dependendo da proteína utilizada (O’TOOLE et al. 2004; GARCIA & REYES 2005 et al; WIKESJÖ et al. 2008; SCHOUTEN et al. 2009).

A escolha pelo GDF-5 baseou-se no fato desse fator de crescimento estimular células indiferenciadas de tecidos conjuntivos a diferenciar-se em células da linhagem osteoblástica, em mecanismo semelhante à ação de BMPs via Smads (NISHITOH et al. 1996; YOSHIMOTO et al. 2006). De fato, o GDF-5 é uma isoforma

Discussão | 60

dos GDFs, os quais, juntamente com as BMPs, fazem parte da superfamília do TGF- β (FRANCIS-WEST et al. 1999; KUNIYASU et al. 2003; YOSHIMOTO et al. 2006). Além disso, o GDF-5 tem efeito conhecido sobre a ALP, promovendo o aumento de sua atividade (SHIMAOKA et al. 2004). No tecido ósseo, a ALP está confinada à superfície de osteoblastos, incluindo as membranas das vesículas de matriz que essas células secretam, nas quais a ALP é particularmente mais concentrada. Apesar de se propor que o principal efeito da ALP é fornecer fosfato necessário para formação de hidroxiapatita para sua ligação com a matriz colágena, sugere-se, também, que a ALP hidrolise o inibidor de mineralização pirofosfato, facilitando a precipitação mineral e a formação da matriz óssea (MILLÁN 2006). Portanto, o aumento de atividade de ALP nas culturas estimuladas pela funcionalização com GDF-5 poderia alterar o equilíbrio fosfato/pirofosfato, o qual é considerado fator determinante para a mineralização da matriz extracelular.

Como o fenômeno de adsorção de proteínas sobre substratos sólidos é afetado pelos aspectos topográficos de superfície na nanoescala, podendo alterar a orientação e a conformação de proteínas (LORD et al. 2010; RICHERT et al. 2010) e, consequentemente, a sinalização celular, decidiu-se por avaliar o impacto do tempo de condicionamento da superfície de Ti sobre a adsorção de GDF-5 e seus efeitos sobre parâmetros importantes do desenvolvimento do fenótipo osteogênico in vitro. Com efeito, alterações nos aspectos nanotopográficos de superfícies metálicas

condicionadas por H2SO4/H2O2 podem ser obtidos quando se variam o tempo e a

temperatura de condicionamento, bem como as proporções relativas entre ácidos (ou mesmo bases) e soluções oxidantes (VARIOLA et al. 2009; VETRONE et al. 2009). No presente estudo, a análise qualitativa por MEV de alta resolução mostrou que nanocavidades de dimensões maiores formavam-se após o condicionamento de

Discussão | 61

4h, mas não de 30’, e que os aspectos topográficos de nanocavidades mantinham- se aparentemente inalterados com a adsorção de GDF-5 na concentração utilizada (200 ng/mL). Análise preliminar por microscopia de força atômica revelou valores de nanorugosidade (RMS, root mean square) para área de 1x1 µm2 variando entre 4 e 8 nm para os diferentes grupos experimentais (Controle, 4,8 nm; 30’, 5,9 nm; 30’+GDF-5, 5,2 nm; 4h, 7,6 nm; 4h+GDF-5, 6,4 nm). As diferenças entre os condicionamentos de 30’ e 4h por si só resultaram em modificações na progressão das culturas osteogênicas, possivelmente devido à própria nanotopografia ou à adsorção diferencial de proteínas do soro presentes no meio de cultura. Além disso, alterações em determinados parâmetros atribuídas à disponibilização do GDF-5, como a expressão de OPN em 10 dias, foram claramente afetadas pelo tempo de condicionamento das superfícies de Ti, provavelmente modificando a adsorção de GDF-5. Estudos posteriores deveriam avaliar os diferentes aspectos do processo de adsorção de proteínas sobre nanotopografias de Ti, utilizando, por exemplo, o método IRRAS (infrared reflection-absorption spectroscopy; MENDELSOHN et al.

2010), de grande importância e versatilidade para a compreensão das interações de moléculas orgânicas com substratos metálicos (TRANSFERETTI & DAVANZO 2001).

Um dos métodos quantitativos utilizados para avaliar a atividade osteogênica

in vitro sobre os diferentes substratos de Ti foi a análise da expressão de RNAm de

marcadores da diferenciação osteoblástica em 7 e 10 dias das culturas primárias, que representam, para substratos planos na micro e nanoescala, o final da fase proliferativa e o início do processo de mineralização da MEC, respectivamente. Nesse modelo experimental, com a adição de ácido ascórbico e beta-glicerofosfato, desenvolvem-se formações nodulares mineralizadas semelhantes ao tecido ósseo

Discussão | 62

imaturo, as quais resultam da expansão clonal de células osteoprogenitoras e da subsequente aquisição do fenótipo osteoblástico (NANCI et al. 1996; BELLOWS et al.1986; BELLOWS et al. 1989; STEIN et al. 1993). O potencial osteogênico das culturas está, portanto, diretamente relacionado ao recrutamento seletivo de células indiferenciadas, à taxa de proliferação de células osteoprogenitoras, ao número de osteoblastos ativos e a seu tempo de vida/atividade, bem como à estimulação da atividade de síntese dessas células (revisado por DE OLIVEIRA et al. 2007). Qualquer variação que ocorra nesses aspectos, determinada pelos diferentes substratos, pode se refletir no perfil de expressão de marcadores da diferenciação osteoblástica, tanto iniciais (por exemplo, RUNX2, ALP e BSP) como de fases mais avançadas (por exemplo, OPN e osteocalcina). Assim, qualquer análise da expressão de marcadores osteoblásticos deveria, idealmente, ser realizada conjuntamente com a avaliação do potencial osteogênico das culturas.

Em relação à expressão dos marcadores iniciais, os resultados deste estudo mostraram valores maiores de RUNX2, ALP e BSP em 10 dias para o Controle, de menor potencial osteogênico, enquanto que a menor expressão desses marcadores ocorreu para 4h+GDF-5, que estimulava a mineralização, sugerindo aceleração da aquisição do fenótipo osteoblástico. Essa interpretação reforça-se quando se consideram a menor expressão de RUNX2, ALP e BSP e a maior de OPN em 10 dias para as culturas expostas ao GDF-5, cujos valores de extração de ARS foram maiores do que os de seus respectivos controles. Assim, os picos de expressão dos marcadores iniciais, esperados para culturas de alto potencial osteogênico, teriam ocorrido possivelmente em tempos anteriores ao de 10 dias, não avaliados neste estudo. Dos marcadores iniciais utilizados, apenas a expressão de BSP em 7 dias correlacionava-se positivamente com o maior potencial osteogênico das culturas

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sobre 4h+GDF-5. Em relação à ALP, cuja expressão/atividade é reconhecidamente afetada pelo GDF-5 (SHIMAOKA et al. 2004), não se detectaram diferenças na expressão de RNAm sobre nanotopografias funcionalizadas com esse fator. No entanto, a atividade de ALP foi significativamente maior em 10 dias para esses grupos, correlacionando-se positivamente com a maior mineralização da MEC.

Culturas osteogênicas sobre superfícies de Ti com nanotopografia exibem abundante marcação extracelular para OPN em tempos iniciais pós-plaqueamento (DE OLIVEIRA & NANCI 2004; DE OLIVEIRA et al. 2007; VETRONE et al. 2009). Apesar de não se ter esclarecido se isso ocorre por aumento da adsorção dessa proteína ao substrato nanoestruturado, por aumento de sua secreção ou ambos os fatores, esse fenômeno parece estar intimamente ligado ao aumento de áreas de mineralização dessas culturas. No presente estudo, observou-se que a nanotopografia de 30’ não favoreceu a formação de acúmulos extracelulares de OPN, os quais eram observados para essa nanotopografia apenas com a adsorção de GDF-5, quando se obtinham valores maiores de extração de ARS.

Os resultados das análises morfológica e bioquímica com ARS não foram coincidentes. Maiores proporções de áreas coradas em vermelho ocorreram nos grupos 4h e 4h+GDF-5, o que poderia ser atribuído ao efeito da nanotopografia obtida pelo condicionamento com H2SO4/H2O2 por 4 h. No entanto, a análise

bioquímica revelou valores maiores de extração de ARS para as nanotopografias com GDF-5, ficando evidente que, com essa análise, o GDF-5 teve uma influência maior do que as nanotopografias obtidas pelos dois tempos de condicionamento. Uma explicação possível estaria ligada a acúmulos maiores de cálcio em formações nodulares mais espessas das culturas expostas ao GDF-5, indicando maior atividade de células osteoblásticas nessas condições de cultivo.

Conclusão | 65

5 CONCLUSÃO:

Conclui-se que a funcionalização de nanotopografias de Ti por simples adsorção de GDF-5 pode estimular o desenvolvimento do fenótipo osteogênico em culturas primárias de calvárias de ratos, aumentando a atividade de ALP e o processo de mineralização da MEC. A nanotopografia por condicionamento de 4 h parece favorecer os eventos finais da cultura quando comparada com a de 30’. Estudos posteriores em modelos animais deverão avaliar a relevância de se utilizar tal estratégia visando a favorecer a osseointegração de implantes metálicos, sobretudo em áreas de baixa qualidade óssea e com carga imediata.