Del 2 Metodiske krav til informasjonsinnhentingen
2.5 Krav til informasjonsinnhentingsprosedyren
Nesta secção encontra-se a descrição do método utilizado no decorrer do trabalho para a quantificação de resíduos de dexametasona por HPLC.
A metodologia utilizada para avaliar a recuperação de resíduos de dexametasona foi desenvolvida e validada com base na monografia Dexamethasone (Monografias USP e EP, 2010).
- Fluxo: 1,0 mL/min - Detecção: UV a 254 nm
- Volume de injecção: 25 µl
- Temperatura da coluna: Temperatura ambiente (controlada) - Temperatura amostra: Temperatura ambiente (18ºC) - Tempo de corrida: 10 minutos
- Fase Móvel: Acetonitrilo: H2O (45:55 v/v)
- Solvente: Etanol
2.2.2.1 Selectividade 1. Solvente de extracção
Etanol (para limpeza da superfície do equipamento) 2. Branco do swab + placa aço inox ou placa silicone
Placa Inox e Placa silicone – Limpar a placa com dois e um swabs, respectivamente, simulando um ensaio (proceder de acordo com o ponto 2.2.2.5 (Extracção / Recuperação).
3. Solução de detergentes a 33 µg/mL (P3 Cosa Pur 80)
Solução Stock Solução Trabalho
Substância Quantidade (mg) V (mL (a) C (µg/mL) Aliquota (mL) V (mL) (a) C (µg/mL)
Detergente 33,0 100 330,0 1 10 33,0
(a) Solvente: H2O
4. Solução Placebo (equivalente a uma amostra a 0,56 µg/mL e 0,65 µg/mL) Solução de placebo equivalente a 0,56 µg/mL
Solução Stock Solução Intermédia Solução Trabalho
Substância Quantidade (mg) (mL(a)(c) V (µg/mL) C Aliquota (mL) (mL) V (b) C (µg/mL) Aliquota (mL) V (mL) (b) C (µg/mL) Placebo 8 mg (Prosolv+ Croscarmelose) 140,0 100 --- 1 10 --- 4 10 --- (a) H2O (b) Solvente: etanol (c) Centrifugar 10min. A 4400rpm
78 Solução de placebo equivalente a 0,65 µg/mL
Solução Stock Solução Intermédia Solução Trabalho
Substância Quantidade (mg) (mL(a)(c) V (µg/mL) C Aliquota (mL) (mL) V (b) C (µg/mL) Aliquota (mL) V (mL) (b) C (µg/mL) Placebo 162,5 100 --- 1 10 --- 4 10 --- (a) H2O (b) Solvente: etanol (c) Centrifugar 10 min. A 4400 rpm 5. Solução de Referência a 0,56 µg/mL e 0,65 µg/mL Solução de referência a 0,56 µg/mL
Solução Stock Solução Intermédia Solução Trabalho
Substância Quantidade (mg) (mL) V (a) C (µg/mL) Aliquota (mL) V (mL) (a) C (µg/mL) Aliquota (mL) V (mL) (a) (µg/mL) C Dexametasona 14,0 100 140,0 1 100 1,4 4 10 0,56 (a) Solvente: etanol
Solução de referência a 0,65 µg/mL
Solução Stock Solução Intermédia Solução Trabalho
Substância Quantidade (mg) (mL) V (a) C (µg/mL) Aliquota (mL) V (mL) (a) C (µg/mL) Aliquota (mL) V (mL) (a) C (µg/mL) Dexametasona 13,0 100 130,0 1 100 1,3 5 10 0,65 (a) Solvente: etanol
6. Solução LOQ
Solução Stock Solução Intermédia Solução Trabalho
Substância Quantidade (mg) V (mL (a) C (µg/mL) Aliquota (mL) V (mL) (a) C (µg/mL) Aliquota (mL) V (mL) (a) C (µg/mL) Dexametasona (0,56 µg/mL) 14,0 100 140,0 1 100 1,4 1 20 0,07 Dexametasona (0,65 µg/mL) 16,25 100 162,5 1 100 1,6 1 20 0,08 (a) Solvente: etanol
7. Solução Amostra de Limpeza
Proceder de acordo com o descrito no ponto 2.2.2.5 (Extracção / Recuperação).
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2.2.2.2 Linearidade (0,56 µg/mL e 0,65 µg/mL) Solução Stock (SS) – 0,56 µg/mL
Solução Stock (SS) Solução Intermédia (SI) Substância Quantidade (mg) V (mL) (a) (µg/mL) C Aliquota (mL) V (mL) (a) C (µg/mL) Dexametasona
(0,56 µg/mL) 14,0 100 140,0 1 100 1,4
(a) Solvente: etanol
Soluções de trabalho
Solução Inicial Aliquota (mL) V (mL) (a) C (µg/mL) Nível (%) Identificação da Solução
SI 1 20 0,07 12,5 S1 SI 1 10 0,14 25,0 S2 SI 1,5 10 0,21 37,5 S3 SI 2 10 0,28 50,0 S4 SI 2,5 10 0,35 62,5 S5 SI 3 10 0,42 75,0 S6 SI 4 10 0,56 100,0 S7 SI 5 10 0,70 125,0 S8 SI 6 10 0,84 150,0 S9
(a) Solvente: etanol
Solução Stock (SS) – 0,65 µg/mL
Solução Stock (SS) Solução Intermédia (SI)
Substância Quantidade (mg) (mL) V (a) C (µg/mL) Aliquota (mL) V (mL) (a) C (µg/mL) Dexametasona (0,65 µg/mL) 16,25 100 162,5 1 100 1,6
(a) Solvente: etanol
Soluções de trabalho
Solução Inicial Aliquota (mL) V (mL) (a) C (µg/mL) Nível (%) Identificação da Solução
SI 1 20 0,08 12,5 S1 SI 1 10 0,16 25,0 S2 SI 1,5 10 0,24 37,5 S3 SI 2 10 0,33 50,0 S4 SI 2,5 10 0,41 62,5 S5 SI 3 10 0,49 75,0 S6 SI 4 10 0,65 100,0 S7 SI 5 10 0,81 125,0 S8 SI 6 10 0,98 150,0 S9
80
Ensaio: Injectar cada uma das soluções em duplicado. 2.2.2.3 Limite de Quantificação
Preparação descrita no ponto 2.2.2.1 (Selectividade).
Ensaio: Após a definição do limite de quantificação, injectar seis vezes a solução padrão correspondente.
2.2.2.4 Limite de Detecção Solução LOD
Solução Stock (SS) Solução Intermédia (SI) Substância Quantidade (mg) V (mL) (a) (µg/mL) C Aliquota (mL) V (mL) (a) C (µg/mL) Dexametasona
(0,56 µg/mL) 14,0 100 140,0 1 100 1,4
(a) Solvente: etanol
Solução Inicial Aliquota (mL) V (mL) (a) C (µg/mL) Nível (%)
SI 1 50 0,03 5,0
(a) Solvente: etanol
Ensaio: Após a definição do limite de detecção, injectar duas vezes a solução padrão. 2.2.2.5 Extracção / Recuperação
1) PLACA INOX (0,56 µg/mL) Soluções Amostra
Soluções de sobrecarga
Substância Quantidade (mg) (mL)(a) V (µg/mL) C Sobr. Sol. Aliquota (mL) (mL) V (µg/mL) C Sobr. Sol.
Dexametasona 14,0 100 140,0 S1
1 20 7,0 S2
4 10 56,0 S3
6 10 84,0 S4
(a) Solvente: etanol
Placa sobrecarregada
Nível Sol. Sobr. Aliquota (µl) (a) Volume (mL) (b) C (µg/mL)
LOQ S2 100 10 0,07
Intermédio
(100%) S3 100 10 0,56
Alto
(150%) S4 100 10 0,84
(a) Aplicação com uma micropipeta calibrada.
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Procedimento de amostragem
Após a secagem, cada uma das placas (inox e silicone) deve ser amostrada de acordo com os passos abaixo descritos:
Humedecer o swab no solvente de extracção (etanol) (usar 2 swabs molhados em etanol na placa inox e 1 swab molhado na placa silicone);
Pressionar o swab contra a parede do tubo para retirar o excesso;
Passar o swab na superfície da placa contaminada, uniformemente com um dos lados na direcção horizontal e com o outro lado na direcção vertical para cobrir toda a área (5 cm x 5 cm) (Figura 2.7).
FIGURA 2.7 - Esquema de amostragem com swab
Cortar o cabo do swab e colocá-lo num frasco com tampa; Adicionar 10 mL de solvente de extracção (etanol);
Extrair o contaminante do swab, introduzindo o frasco no ultrassons durante 5 minutos.
Solução Referência
Proceder de acordo com o ponto 2.2.2.1 (Selectividade).
Ensaio: Injectar duas vezes cada solução. 2) PLACA INOX E SILICONE (0,65 µg/mL)
Soluções Amostra
Soluções de sobrecarga
Substância Quantidade (mg) V (mL) (µg/mL) C Sobr. Sol. Aliquota (mL) (mL) V (µg/mL) C Sobr. Sol.
Dexametasona 13,0
100 130,0 S1
1 20 6,5 S2
6 10 65,0 S3
9,8 98,0 S4
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Placa sobrecarregada
Nível Sol. Sobr. Aliquota (µl) (a) Volume (mL) (b) C (µg/mL)
LOQ S2 100 10 0,08
Intermédio
(100%) S3 100 10 0,65
Alto
(150%) S4 100 10 0,98
(a) Aplicação com uma micropipeta calibrada.
(b) Após a solução secar, proceder de acordo com o descrito no procedimento para amostragem
Solução Referência
Proceder de acordo com o ponto 2.2.2.1 (Selectividade).
Ensaio: Injectar duas vezes cada solução.
2.2.2.6 Precisão
a) Repetibilidade de Sistema
A solução referência de analíto ao nível de concentração intermédia (100%), foi preparada como descrito no ponto 2.2.2.1 (Selectividade) e injectada seis vezes.
b) Repetibilidade de análise Soluções Amostra
Seis replicados da solução amostra de limpeza foram preparados ao nível de concentração intermédia (100%) (placa inox: 0,56 µg/mL e 0,65 µg/mL; silicone: 0,65 µg/mL), como descrito no ponto 2.2.2.5 (Extracção / Recuperação).
Solução de referência
A solução referência de analíto ao nível de concentração intermédia, foi preparada como descrito no ponto 2.2.2.1 (Selectividade).
c) Precisão intermédia
Dois analistas diferentes, em dias diferentes, prepararam 6 replicados da solução amostra de limpeza (em ambas as placas de inox e silicone) ao nível de concentração intermédio (100%) (placa inox: 0,56 µg/mL e 0,65 µg/mL; silicone: 0,65 µg/mL), assim como a solução de referência, descritas no ponto 2.2.2.1 (Selectividade).
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2.2.2.7 Estabilidade
Estabilidade em placas
Foram preparados dois replicados de cada uma das placas, sobrecarregando-as com a substância activa ao nível de concentração intermédia (100%) (placa inox: 0,56 µg/mL e 0,65 µg/mL; silicone: 0,65 µg/mL), como descrito no ponto 2.2.2.5 (Extracção / Recuperação). As placas foram guardadas à temperatura ambiente (20-24ºC), e protegidas da luz. Ambas as placas foram mantidas durante 72h. Após este período de tempo, procedeu-se à limpeza das placas, de acordo com o descrito no 2.2.2.5 (Extracção / Recuperação).
Solução de referência
A solução referência de analíto ao nível de concentração intermédia, foi preparada como descrito no ponto 2.2.2.1 (Selectividade).
Estabilidade de soluções
Foram preparadas soluções amostra de limpeza, sobrecarregando as placas com a substância activa ao nível de concentração intermédia (placa inox: 0,56 µg/mL e 0,65 µg/mL; sílica: 0,65 µg/mL), de acordo com o descrito no ponto 2.2.2.5 (Extracção / Recuperação).
Cada uma destas soluções foi dividida em três alíquotas, guardando uma a temperatura ambiente (20 – 24ºC) na bancada de trabalho, não protegida da luz, outra a 5oC protegida da luz, durante 3 dias e outra no injector do HPLC (18ºC).
Solução de referência
A solução referência de analíto ao nível de concentração intermédia, foi preparada como descrito no ponto 2.2.2.1, a cada tempo de análise (Selectividade).
Ensaio: Injectar duas vezes cada solução.
2.2.2.8 System Suitability
A solução referência de analíto ao nível de concentração intermédia, foi preparada como descrito no ponto 2.2.2.1 (Selectividade).
3. RESULTADOS E
DISCUSSÃO
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3.1 Resultados obtidos no desenvolvimento e validação do Método Analítico