Os resultados do ensaio do cometa para avaliação de dano nuclear em macrófagos foram obtidos através da medida de fragmentação do DNA na cauda do nucleóide e estão demonstrados nas Figuras 47 e 48.
Figura 47. Ensaio do cometa realizado em células AMJ2 – C11 infectadas com H. capsulatum, demonstrando os
níveis de danos ao DNA, através da fragmentação de DNA na cauda. (CN) Controle negativo de células normais, não infectadas; (60I) Infecção com a cepa 60I de H. capsulatum; (EH-315) Infecção com a cepa EH-315 de H. capsulatum. Tempo (minutos) H. capsulatum EH-335 (ATCC) (UFC/mL) H. capsulatum EH-315 (UFC/mL) H. capsulatum 60I (UFC/mL) 0 7 15 30 60 120 180 300 0 17 13 18 17 19 7 29 0 177 267 507 530 693 301 1080 0 86 134 161 171 22 39 174
Figura 48. Avaliação de fragmentação nuclear por meio do teste do cometa em linhagem celular AMJ2 – C11
infectada com as cepas 60I e EH-315 de H. capsulatum. Controle Negativo (CN – células normais, sem infecção). Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn’s (***) P<0.05.
Na análise de fragmentação nuclear de macrófagos por H. capsulatum, as porcentagens de danos ao DNA foram correspondentes à porcentagem de DNA na cauda do cometa e demonstram que para as duas cepas testadas, 60I e EH-315, ocorre dano de DNA, respectivamente, de 10,78 ± 1,31% e 10,67 ± 0,91% de dano, apresentando diferença significativa quando comparadas ao controle negativo (1,75 ± 0,18%) (Tabela 6).
Tabela 6. Avaliação da fragmentação nuclear de duas cepas de H. capsulatum (60I e EH-315) frente à linhagem
celular AMJ2 – C11 com 5 horas de infecção.
Condições testadas % de DNA na cauda ± EP
CN 1,75 ± 0,18
Cepa 60I Cepa EH-315
10,78 ± 1,31*** 10,67 ± 0,91***
CN: Controle negativo (células normais). EP: Erro padrão. Comparação entre os grupos através do teste de variância
4.4.7. Método TUNEL
Foi detectada a fragmentação do DNA em macrófagos alveolares AMJ2-C11 infectados separadamente com duas cepas de H. capsulatum, EH-315 e 60I, em diferentes tempos de infecção, 30 minutos, 2 e 5 horas. Células normais não infectadas foram utilizadas como controle. As imagens foram adquiridas pelo equipamento IN Cell Analyzer 2000 System e os resultados foram avaliados pelo software Investigator 1000 Workstation, através da análise comparativa da fluorescência emitida pelo núcleo dos macrófagos nas três diferentes situações. Os resultados indicam uma marcação de TUNEL semelhante entre as 2 cepas de H. capsulatum e o controle de células normais até 30 minutos de infecção. Após 2 e 5 horas de contato entre ambas as cepas e macrófagos é possível observar um aumento de 2 vezes na marcação de TUNEL resultante da fragmentação de DNA, quando comparado com os macrófagos não infectados, como demonstrado na figura 49. A figura 50 ilustra as imagens adquiridas pelo IN Cell Analyzer resultantes da marcação de TUNEL.
Figura 49. Detecção de fragmentação de DNA em macrófagos alveolares AMJ2-C11 infectados com as cepas EH-
315 e 60I de H. capsulatum e em macrófagos não infectados (células normais), pelo método TUNEL. Valores resultantes da análise das imagens utilizando o software Investigator 1000 Workstation. Resultados expressos em intensidade de fluorescência emitida pelo núcleo dos macrófagos.
Figura 50. Imagens adquiridas pelo IN Cell Analyzer 2000 System para análise de fragmentação de DNA em macrófagos alveolares AMJ2-C11 infectados com as cepas EH-315 e 60I de H. capsulatum e em macrófagos não
infectados, pelo método TUNEL. Infecção com a cepa EH-315 (A) e 60I (B) após 30 minutos; Infecção com a cepa EH-315 (D) e 60 I (E) após 2 horas; Infecção com a cepa EH-315 (G) e 60 I (H) após 5 horas. Controle de células normais não infectadas após 30 minutos (C), 2 horas (F) e 5 horas (I).
5. DISCUSSÃO
Interações de fungos patogênicos humanos com os tecidos do hospedeiro são fatores essenciais na patogênese das micoses (Tronchin, Pihet et al., 2008). Este estudo demonstrou a capacidade das leveduras de H. capsulatum em aderir a pneumócitos e a sua habilidade em formar biofilme. Na literatura, esta característica nunca foi destacada, sendo considerada, dessa forma, como um novo fator de virulência de H. capsulatum. Este fungo infecta fagócitos profissionais (neutrófilos, macrófagos e células dendríticas) ou não-profissionais (células endoteliais e epiteliais). Em função da sua preferência intracelular, o fungo evita a exposição às espécies reativas de oxigênio e espécies reativas de nitrogênio tóxicas (Nittler, Hocking-Murray et al., 2005) para o sucesso do parasitismo e com o objetivo de impedir o efeito da opsonização na capacidade de proliferação dos organismos dentro dos macrófagos. As leveduras demonstraram essa capacidade em células endoteliais e epiteliais alveolares, sugerindo que as células endoteliais infectadas podem facilitar a propagação fúngica por via hematogênica (Kurokawa, Sugizaki et al., 1998).
A demonstração de que as leveduras de H. capsulatum podem aderir a criosecções de diferentes órgãos também fornece evidências de um importante mecanismo para colonização e disseminação das leveduras, que envolve a aderência celular dos organismos aos tecidos do hospedeiro, provavelmente incluindo superfície celular e componentes extracelulares (Suárez- Alvarez, Pérez-Torres et al., 2010).
Os resultados aqui demonstrados indicam que ambas as cepas de H. capsulatum foram capazes de formar biofilme e aderir às células epiteliais (A549), caracterizadas como pneumócitos. Um grande número de leveduras foi observado, aderidas na linhagem celular descrita (Figura 33).
A adesão microbiana pode ser dividida em dois estágios, primário e secundário. O primeiro estágio é reversível e é determinado pelas interações físico-químicas tais como hidrofobicidade, forças eletrostáticas e de Van der Waals, temperatura e forças hidrodinâmicas, que determinam a adesão entre a célula microbiana e a área de interesse. A aderência secundária ocorre entre adesinas moleculares para uma superfície específica, na qual o microrganismo consolida a fixação, produzindo um complexo exopolissacarídico e/ou receptores ligantes específicos para o material de superfície ou células. No final deste estágio, a aderência é considerada irreversível (Costerton, Cheng et al., 1987; Vesterlund, Paltta et al., 2005).
Muitas adesinas de diferentes ligantes no hospedeiro, algumas vezes com propriedades multifuncionais, têm sido descritas. Algumas delas têm sido caracterizadas, e a sua expressão analisada de acordo com mudanças morfológicas ou condições de cultivo. Para alguns ligantes, motifs de aminoácidos ou carboidratos foram identificados como participantes desta interação. Várias proteínas ou glicoproteínas do hospedeiro têm sido sugeridas como ligantes, incluindo componentes dos fluidos biológicos, matriz extracelular e membrana basal de proteínas. Há descrição das mesmas características de aderência a vários tipos celulares, principalmente células epiteliais e endoteliais, ou à biomateriais (Tronchin, Pihet et al., 2008). A adesão é um pré-requisito para a colonização e um passo essencial para o estabelecimento da infecção. Vários estudos têm demonstrado o potencial de adesão de isolados de Candida spp. às células epiteliais (Chaffin, López-Ribot et al., 1998; Tronchin, Pihet et al., 2008). Neste estudo, esta característica de adesão foi demonstrada para H. capsulatum.
Diversos estudos de interação entre fungos, principalmente Paracoccidioides brasiliensis, e modelos de cultura de células têm sido amplamente estudados em nosso laboratório (Mendes-Giannini, Hanna et al., 2004; Mendes-Giannini, Monteiro Da Silva et al., 2008; Del Vecchio, Silva et al., 2009). Neste estudo, foi avaliada a taxa de adesão de três diferentes cepas de H. capsulatum, EH-335 (ATCC), EH-315 e 60I, em células epiteliais pulmonares A549. O número de leveduras aderentes foi determinado através da contagem de colônias resultantes após 24 horas do plaqueamento, resultando no índice de adesão em UFC/mL.
Os resultados deste ensaio indicam que a taxa de adesão é crescente no período de 7 a 60 minutos. Em 120 e 180 minutos após a infecção observa-se uma queda no número de leveduras aderidas e, em seguida, após 300 minutos verifica-se a maior taxa de adesão para todas as cepas (EH-335, EH-315 e 60I), com um aumento significativo do número de leveduras aderidas às células epiteliais. Este fato sugere que entre 60 e 180 minutos as leveduras invadem as células em cultura e, após esse período há multiplicação das mesmas na região extracelular, que rapidamente aderem à membrana celular de pneumócitos. A utilização do plaqueamento em superfície para determinar a adesão de fungos à células humanas foi recentemente descrito por Sardi, Duque et al. (2012) com o modelo Candida albicans. Os resultados do estudo citado anteriormente indicam que em C. albicans, a adesão ocorre após 2 horas de infecção com fibroblastos humanos em cultura e a invasão, após 4
horas. Para fungos dimórficos, Del Vecchio, Silva et al. (2009); Peres Da Silva, Matsumoto et al. (2011) verificaram que a internalização de P. brasiliensis às células epiteliais A549 ocorre após 5 horas de infecção. Dessa forma, H. capsulatum é capaz de iniciar a adesão à pneumócitos em 7 minutos após a infecção. Além disso, este fungo exibe um potencial de invasão maior, que se inicia após 1 hora de infecção, quando comparado a outros fungos patogênicos como C. albicans e P. brasiliensis, que invadem após 4 e 5 horas de infecção, respectivamente.
Verstrepen e Klis (2006) enfatizaram a notável capacidade de formação de biofilme devido à propriedade de adesão de alguns fungos, sendo C. albicans o modelo mais estudado até o momento. Esta característica tem grande importância médica, uma vez que a presença de um biofilme maduro afeta negativamente a ação de agentes antifúngicos e o biofilme pode se tornar um reservatório de células resistentes a certos medicamentos. A parede celular dos fungos é extremamente importante na patogênese desses microrganismos, promovendo a adesão aos tecidos do hospedeiro e também participando na imunomodulação da resposta imune (Chaffin, López-Ribot et al., 1998).
A formação do biofilme representa a forma mais comum de crescimento dos microrganismos na natureza, um estado que permite que as células microbianas possam sobreviver em ambientes hostis e dispersar para colonização de novos nichos (Donlan e Costerton, 2002).
Atualmente, há um grande interesse sobre o papel dos biofilmes nas doenças infecciosas. De acordo com os Centros de Controle de Doenças, 65% das infecções humanas resultam de biofilmes patogênicos (Costerton, 2001). Enquanto que um anúncio público do Instituto Nacional de Saúde, estima que 80% das infecções humanas são relacionadas a formação de biofilmes. Biofilmes fúngicos constituem um problema clínico crescente associado com altas taxas de mortalidade (Williams e Costerton, 2012).
No presente estudo, a quantificação do biofilme de H. capsulatum foi realizada in vitro conforme descrito previamente por Martinez e Casadevall (2007). A utilização deste ensaio é explicado por (Zhou, Wang et al., 2012), no qual os autores relatam que o ensaio de redução do XTT tem sido amplamente utilizado nos últimos anos. XTT é um novo sal de tetrazólio de coloração amarela que é convertido à formazana corada na presença de atividade metabólica. Uma vez que o produto de formazana é solúvel em água, este pode ser facilmente medido no sobrenadante celular, o que se torna extremamente importante na pesquisa de
biofilmes, permitindo o estudo de biofilmes intactos, bem como a realização de testes de sensibilidade a drogas sem o rompimento da estrutura do mesmo. Dessa forma, através da utilização do método espectrofotométrico e o ensaio de redução do XTT neste estudo, foi possível avaliar o crescimento do biofilme fúngico com precisão.
As características de algumas moléculas de superfície de um parasita podem ser importantes nos padrões de aderência do microrganismo e na seleção da rota de internalização para as células do hospedeiro, bem como na disseminação extracelular (Suárez-Alvarez, Pérez-Torres et al., 2010). Uma interação mediada por lectina entre leveduras de H. capsulatum e as células do hospedeiro tem sido considerada, na qual a atividade da lectina está associada com um componente presente na superfície celular da levedura. Esta atividade da lectina é específica para moléculas de superfície galactosiladas (principalmente β- anômero) em macrófagos murinos (Taylor, Duarte-Escalante et al., 1998; Mendes-Giannini, Taylor et al., 2000; Duarte-Escalante, Zenteno et al., 2003). Leveduras de H. capsulatum também têm a capacidade de se ligar e aglutinar eritrócitos humanos através da atividade da lectina (Taylor, Duarte-Escalante et al., 2004). O significado biológico destes resultados parece estar relacionado aos aspectos de disseminação e patogênese da doença clínica associada (Pérez-Torres, Rosas-Rosas et al., 2009).
A atual descoberta da formação de biofilme por leveduras de H. capsulatum, caracterizado pelo agrupamento de células leveduriformes, pode ser um fator diretamente associado à capacidade do microrganismo em evitar a sua eliminação pelo sistema imune, em contraste com uma célula leveduriforme isolada, que seria facilmente eliminada. No entanto, é necessário melhor entendimento do papel deste mecanismo na gravidade e patogênese da histoplasmose. Neste contexto, seria interessante conhecer a associação entre a virulência das cepas e a formação de biofilme, considerando que cepas de H. capsulatum de baixa virulência exigem um tempo maior para a transição micélio-levedura a 37°C, em contraste com as cepas mais virulentas que são capazes de resistir a variações de temperatura e converter mais rapidamente à fase leveduriforme (Medoff, Maresca et al., 1986; Medoff, Sacco et al., 1986).
Este é o primeiro estudo que relata a formação de biofilme por H. capsulatum e descreve uma possível associação entre a capacidade deste fungo em formar biofilme e o padrão de adesão das leveduras às células epiteliais A549. Neste contexto, o sequenciamento e a identificação das proteínas expressas pelo fungo em biofilme através da espectrometria de massas, irão elucidar importantes mecanismos envolvidos na patogênese de H. capsulatum.
As tecnologias proteômicas têm sido amplamente exploradas por indústrias farmacêuticas e de biotecnologia para o desenvolvimento de drogas mais eficazes e seguras. Atualmente há um grande interesse na busca de drogas efetivas contra novos alvos e, neste contexto, as proteínas destacam-se, uma vez que a identificação de um alvo protéico essencial à célula pode fornecer informações importantes para a terapêutica das micoses (Walgren e Thompson, 2004; Gomase, Kale et al., 2008).
Nosso grupo demonstrou recentemente a formação de biofilme como um fator de virulência determinante na patogênese fúngica de H. capsulatum (Pitangui, Sardi et al., 2012). No entanto, estudos adicionais acerca deste mecanismo são necessários. Dessa forma, foi realizada análise proteômica diferencial entre H. capsulatum em biofilme e em crescimento planctônico. As condições de extração, separação das proteínas por eletroforese bidimensional e digestão protéica foram otimizadas de forma a obter melhor resolução dos spots, repetibilidade dos resultados e identificação dos peptídeos das proteínas de interesse por espectrometria de massas.
A separação das proteínas da cepa EH-315 de H. capsulatum, por eletroforese bidimensional, usando um gradiente de pH de 3-10 (Figura 13) demonstrou que ocorre um predomínio de proteínas com pI entre 4-7. Portanto, testes preliminares de separação protéica com fitas de pH de 3-10 apresentaram baixa eficiência de identificação, sendo dessa forma, adotadas as fitas de pH 4-7 (Figuras 14 e 15).
A técnica adotada para revelação dos spots, utilizando Azul de Coomassie G-250, demonstrou ser reprodutível e compatível com a espectrometria de massas. Além disso, permitiu a visualização de um grande número de proteínas, uma vez que constitui um método sensível capaz de detectar proteínas com concentrações de até 1ng (Candiano, Bruschi et al., 2004).
A análise dos géis bidimensionais com fitas de pH 4-7 (Figuras 14 e 15) utilizando o programa ImageMaster 2D Platinum demonstrou reprodutibilidade nos resultados. Após a detecção automática, foi realizada uma edição manual com correção, adição e remoção dos spots para posterior digestão protéica e seqüenciamento por MALDI-TOF/TOF.
Os spots identificados foram classificados em categorias funcionais (Figura 21), de forma que foi identificado o maior número de proteínas na categoria relacionada ao metabolismo de aminoácidos e proteínas, incluindo 6 spots (9,6%). Foram identificadas também 5 proteínas nucleares (8,06%) relacionadas à ligação ao DNA e metilação da histona
e 1 (1,6%) envolvida no metabolismo de carboidratos. Além disso, 5 proteínas (8,06%) envolvidas na tradução foram identificadas e 1 proteína (1,6%) ribossomal. Na categoria das proteínas relacionadas ao transporte transmembrana de íons foram identificadas 3 proteínas (4,8%). 2 (3,2%) foram caracterizadas como proteínas antioxidantes e 2 (3,2%) envolvidas nos processos de oxi-redução. 2 proteínas (3,2%) se classificam como parte da arquitetura da parede celular e 1 outra (1,6%) como constituinte do citoesqueleto, tendo ligação específica aos microtúbulos. Foram ainda identificadas 3 proteínas (4,8%) envolvidas na sinalização celular, importantes no reconhecimento célula-célula e 2 proteínas (3,2%) que atuam na resposta ao estresse ambiental ou fisiológico, aos quais o microrganismo pode estar submetido. Apenas 1 proteína (1,6%) foi identificada como proteína de choque térmico, atuando como chaperona. Além destas foram identificadas 8 proteínas (13%) que incluem Eryngin, Cutinase 2, Mating hormone A-factor 1 e Cassiicolin que não se encaixam em nenhuma das categorias funcionais descritas anteriormente. 20 proteínas (32,2%) identificadas não apresentam função conhecida e descrita na literatura.
Dessa forma, mais de 40 proteínas pertencentes a diversos grupos funcionais foram diferencialmente expressas e identificadas entre o biofilme e as células dispersas. Isso sugere que o proteoma do biofilme de H. capsulatum é complexo e envolve uma modulação geral da fisiologia celular para que as leveduras possam formar biofilme. Além disso, pouco se sabe sobre a função das proteínas neste fungo. Um número restrito de trabalhos descreve a análise proteômica da fase leveduriforme de H. capsulatum, a maioria deles destinado ao estudo dos mecanismos de produção extracelular de vesículas envolvidas na patogênese fúngica (Albuquerque, Nakayasu et al., 2008; Nosanchuk, Nimrichter et al., 2008).
Há um padrão na síntese de proteínas que correspondem à mudança no estilo de vida do fungo de móvel para séssil, sendo que as três principais categorias funcionais incluem proteínas envolvidas no metabolismo de aminoácidos, proteínas nucleares e proteínas de tradução e processamento do RNA.
O grupo funcional com proteínas envolvidas no metabolismo de aminoácidos inclui: Alkaline proteinases, Putative uncharacterized protein YML012C-A, Putative uncharacterized protein YGL024W, Putative uncharacterized protein YDR271C e Plasma membrane proteolipid 3 homolog. A expressão diferencial destas proteínas varia entre 1,21 a 3,25 vezes mais expressa pelo fungo em biofilme quando comparado ao crescimento planctônico e uma das proteínas expressa de forma exclusiva em biofilme (Plasma membrane
proteolipid 3 homolog). Segundo Barrett, Rawlings et al. (2001) as proteases são extremamente importantes em processos fisiológicos e patológicos, uma vez que elas atuam como enzimas proteolíticas que catalisam a hidrólise peptídica em proteínas e fragmentos de proteínas, causando alterações irreverssíveis ou destruição dos substratos (Rao, Tanksale et al., 1998). Em C. albicans, enzimas hidrolíticas como as proteinases são consideradas fator determinante na patogenicidade desta espécie (Tay, Abidin et al., 2011). Estudo realizado por Ramage, Coco et al. (2012) relata a produção de proteinases por C. albicans para auxiliar e estabelecer a adesão, invasão e destruição de tecidos. Neste estudo os autores avaliaram a correlação entre os estágios de formação do biofilme em pacientes com estomatite protética e a atividade das proteinases. Os resultados demonstram que a expressão de proteinases está diretamente associada à gravidade da doença, visto que a expressão destas proteínas foi significativamente maior em biofilmes maduros quando comparado às formações iniciais. Dessa forma, a determinação in vitro da atividade das proteinases em biofilmes pode explicar diferenças relacionadas a gravidade da doença.
O grupo funcional das proteínas nucleares inclui 5 proteínas: Transcription factor tau subunit sfc7, SWR1-complex protein 5, Histone-lysine N-methyltransferase, H3 lysine-36 specific, Probable cytosolic iron-sulfur protein assembly protein 1 e Putative DNA helicase INO80. Estas proteínas apresentaram um aumento da expressão em biofilme que varia entre 1,23 e 4,20. Entre elas, destacam-se as histonas e as proteínas de remodelagem da cromatina (SWR1-complex protein 5) que contribuem para a regulação da patogênese. As histonas atuam como reguladores primários da atividade da cromatina, uma vez que são constituintes do nucleossoma que é caracterizado como a unidade básica da cromatina, uma estrutura dinâmica, composta de DNA e proteínas ligantes de DNA que permitem o armazenamento e utilização da informação genética de forma eficiente (Taverna, Li et al., 2007). Alguns estudos relatam que mutantes em histona e membros de remodelagem da cromatina apresentam falhas na transição micélio-levedura, na adesão em células epiteliais, na resistência ao estresse e/ou na atividade antifúngica, promovendo um efeito direto na virulência de C. albicans (Smith e Edlind, 2002; Mao, Cao et al., 2006; Raman, Nguyen et al., 2006; Lu, Su et al., 2008). Dessa forma, o aumento da expressão de proteínas nucleares, provavelmente, auxilia na adesão célula-célula para formação da arquitetura tridimensional do biofilme.
Na categoria funcional de proteínas envolvidas na tradução e processamento do RNA foram identificadas 5 proteínas, entre elas Protein VTS1, Small nuclear ribonucleoprotein G, U6 snRNA-associated Sm-like protein LSm6, U3 small nucleolar RNA-associated protein 10 e tRNA-dihydrouridine synthase 3. A expressão diferencial varia entre 1,05 a 2,28 vezes mais expressa pelo fungo em biofilme quando comparado ao crescimento planctônico. As proteínas de ligação ao RNA tem um papel importante em muitos processos metabólicos, incluindo o processamento e splicing de RNA, transcrição de DNA e tradução de RNA (Rajkowitsch, Chen et al., 2007). Atualmente, não há dados na literatura que correlacionam a formação do biofilme com o aumento da expressão de proteínas de tradução. Em vista disso, as proteínas identificadas revelam características peculiares do biofilme de H. capsulatum nunca antes descritas na literatura.
Além das principais categorias funcionais descritas anteriormente, o proteoma do biofilme de H. capsulatum também identificou proteínas de transporte, carreadoras de ATP, destacando-se entre elas Putative uncharacterized protein YDR354C-A, Putative ATP synthase protein 8-like protein e ATP synthase protein 8. Estas proteínas parecem ter um papel fundamental na energia necessária ao patógeno, para o transporte e fornecimento do