4. EMPIRICAL FINDINGS
4.2 Initiator
Para av aliação dos diâmetros dos halos de inibição do crescimento microbiano, foi utilizada, neste estudo, análise de variância de três fatores: tipo de agente des infetante, período de análise e placa de Petri, sendo que o efeito des te último fator é aleatório e está aninhado no período de análise. Essa análise foi complementada por comparações múltiplas pelo teste Tukey, ambos ao nív el de significância de 5%. As exigências da análise de v ariância de homogeneidade e de normalidade dos erros experimentais fora m prov adas, respectiv amente, pelos testes de Levene e de Shapiro-W ilk.
5 RESULTADO
A análise estatística utilizada foi realizada separadamente para cada microorganismo estudado, uma v ez que eles apresentam características celulares e comportamentos diferentes .
Nas Tabelas A1 a A4 do apêndic e A são dados os diâmetros , em mm, dos halos de inibição de crescimento dos mic roorganismos
Bacillus subtilis, Escheric hia coli, Staphylococcus aureus e Candida
albicans, respectiv amente, conforme o desinfetante utilizado: solução
de digluconato de clorexidina 2% aplic ada s obre disc o de papel filtro (controle negativo), s olução de digluconato de clorexidina 2% incorporada ao gesso durante a manipulação, e c loridrato de clorexidina 98% incorporado ao gesso durante a manipulação. Alé m dessa div is ão, os diâmetros também foram expressos nessas tabelas de acordo com o período de anális e: de 1 hora e 24 horas, sendo que são dois grupos distintos de 12 placas de Petri para cada microorganis mo.
De acordo c om essas tabelas, pode-se v erificar que independentemente do mic roorganismo analisado, o grupo 1 (controle positiv o) no qual o gesso foi manipulado com água des tilada es téril sempre apresentou v alores nulos dos diâmetros dos halos de inibição, o que indica que não houv e ativ idade antimicrobiana do gesso manipulado da forma padrão.
Para av aliar as médias dos diâmetros dos halos de inibição relativamente a cada microorganis mo foram utilizadas análises de variância de três fatores: tipo de agente des infetante, período de análise e placa de Petri, sendo que o efeito des te último fator é aleatório e está aninhado no período de anális e. Os sumários dessas análises são mos trados nas Tabelas B1 a B4 do apêndice B. Nessas Tabelas são apres entados também os valores-p dos tes tes de Levene e de Shapiro-W ilk de homogeneidade de v ariância e de normalidade dos erros experimentais, res pectiv amente.
Nas Tabelas 1 a 4 estão reunidos as médias e os desvios padrão dos diâmetros dos halos de inibição dos quatro microorganis mos em es tudo. Ess as médias estão representadas graficamente nas Figuras 7 a 10.
Quando a análise de v ariância apontou efeito significativ o de algum fator, o teste de Tukey foi aplic ado para comparações de médias dos nív eis dess e fator duas a duas, sendo que estes resultados estão expressos nas Tabelas 1 a 4 de forma que médias ac ompanhadas de letras iguais não são significativ amente diferentes ao nível de 5%.
Observa-se quanto aos diâmetros dos halos de inibição de
Bacillus subtilis que não há efeito significativ o de interação entre os
agentes des infetantes e os períodos de análise.
Então, os efeitos dos agentes des infetantes (significativo) e dos períodos de anális e (não significativ o) podem ser estudados independentemente. As sim não há diferença significativa entre as médias dos dois períodos de anális e e pode-se estabelecer pelo teste de Tukey, ao nív el de s ignificânc ia de 5%, que para as médias dos diâmetros dos halos de inibição temos a seguinte ordem de ativ idade antimic robiana: digluconato de clorexidina 2% < (c loridrato de clorexidina 98% = controle negativo).
Res ultados sem efeito s ignificativ o de interação entre os agentes desinfetantes e os períodos de análise também foram obtidos com os microorganismos Staphylococcus aureus e Candida albicans. Porém, em relação às médias dos diâmetros dos halos de inibiç ão de desinfetantes para o Staphylococcus aureus os resultados foram: (cloridrato de clorex idina 98% = controle negativ o) < digluconato de clorexidina 2%.
Já para a Candida albicans a solução de digluconato de clorexidina 2% incorporada ao gesso não apres entou ativ idade antimic robiana tendo v alores nulos para os halos de inibiç ão não sendo considerada na análise es tatís tica, e a ativ idade antimicrobiana do cloridrato de clorexidina 98% foi menor que a do grupo controle negativ o.
Para o microorganismo Escherichia coli fic ou ev idenciado efeito de interação, porque a média do controle negativ o no período de análise de 24 horas é menor do que a do controle negativ o no período de 1 hora, enquanto que, para a des infecção com digluconato de clorexidina 2% e com cloridrato de clorexidina 98% incorporados ao gesso, as médias não diferiram nos dois períodos de análise. Há ev idênc ia de diferença significativ a de médias dos diâmetros dos halos de inibiç ão com a seguinte ordem de ativ idade antimicrobiana: cloridrato de clorexidina 98% < digluconato de c lorexidina 2% < controle negativ o (24h) < controle negativ o (1h).
Tab ela 1 - Mé dias e desvi os padrão dos di âmetros do s halo s de inibi ção de
Bacillus subtilis (médias acompanhada s de letras iguai s não são
si gni f icativamente dif erentes pelo test e de Tukey, ao ní vel de 5%).
Desinfetante Estatística Período de análise (h)
1 24
Controle negativo Média 14,53 b 14,59 b Desvio padrão 0,84 0,96 Clorex Média 8,78 a 9,14 a Desvio padrão 0,51 0,71 Cloridr Média 13,84 b 14,50 b Desvio padrão 0,68 0,72
FIGURA 7 - Médias amostrai s (colunas) dos diâmetro s dos halos de inibição de
Bacillus subtilis e interval os de 95% de conf iança para as médias
popul aci onais (barr as verticais). 0 4 8 12 16 20 1 24 Mé dia do s diâm etros (m m )
Período de análise (horas)
Controle negativo Digluconato Cloridrato
Tab ela 2 - Mé dias e desvi os padrão dos di âmetros do s halo s de inibi ção de
Staphylococcus aur eus (média s acompanh adas de letra s i guais não são si gni f icativamente dif erentes pelo test e de Tukey, ao ní vel de 5%).
Desinfetante Estatística Período de análise (h)
1 24
Controle negativo Média 13,15 a 13,49 a Desvio padrão 0,87 0,96 Clorex Média 14,71 b 15,10 b Desvio padrão 0,63 0,77 Cloridr Média 12,82 a 12,85 a Desvio padrão 0,71 0,90
FIGURA 8 - Médias amostrai s (col una s) dos diâmetro s dos halo s de ini bição de
Staphylococcus aur eus e inter valos de 95% de co nf iança para as médias p opulacionais (bar ra s verticais).
0 4 8 12 16 20 1 24 Média do s diâm et ro s (m m)
Período de análise (horas)
Controle negativo Digluconato Cloridrato
Tab ela 3 - Mé dias e desvi os padrão dos di âmetros do s halo s de inibi ção de
Candida albicans (média s acom panhada s de letra s iguais não são si gni f icativamente dif erentes pelo test e de Tukey, ao ní vel de 5%).
Desinfetante Estatística Período de análise (h)
1 24
Controle negativo Média 12,07 b 12,25 b Desvio padrão 1,20 0,87 Clorex Média
Desvio padrão
Cloridr Média 9,09 a 8,61 a Desvio padrão 0,67 0,98
FIGURA 9 - Médias amostrai s (colunas) dos diâmetro s dos halos de inibição de
Candida albicans e inter valos d e 95% de conf i ança para as médias popul aci onais (barr as verticais).
0 4 8 12 16 20 1 24 Média do s diâm et ro s (m m)
Período de análise (horas)
Controle negativo Cloridrato
Tab ela 4 - Mé dias e desvi os padrão dos di âmetros do s halo s de inibi ção de
Escherichia coli (médi as acompanhada s de letras iguai s não são
si gni f icativamente dif erentes pelo test e de Tukey, ao ní vel de 5%).
Desinfetante Estatística Período de análise (h)
1 24
Controle negativo Média 18,00 d 16,64 c Desvio padrão 0,99 0,53 Clorex Média 8,21 b 8,62 b Desvio padrão 0,46 0,68 Cloridr Média 7,36 a 7,31 a Desvio padrão 0,41 0,52
FIGURA 10 - Mé dias amostrais (colunas) dos diâmetro s do s halos d e inibição de
Escherichia col i e i nter valo s de 9 5% de conf iança para as médias popul aci onais (barr as verticais).
0 4 8 12 16 20 1 24 Média do s diâm et ro s (m m)
Período de análise (horas)
Controle negativo Digluconato Cloridrato
6 DISCUSSÃO
A prev alência de doenças contagiosas e seus efeitos nocivos requerem atenção para procedimentos de c ontrole de infecções tanto no consultório odontológico c omo no laboratório de prótese6 7, pois
existe a possibilidade de infecção cruzada entre estes dois
ambientes1 4 , 1 7 , 18 , 2 5, 2 9 , 3 2, 3 3 , 4 6, 5 9 , 7 0. E v ários autores1 4 , 1 8 , 2 9 , 46 enfatizam a
necessidade da adoç ão de diretrizes e protocolos adequados para s e ev itar a infecção cruzada.
Des ta forma, proc edimentos rotineiros de proteç ão indiv idual como o uso de luv as, máscaras, gorros, óculos e jaleco, lav agem das mãos, além de procedimentos de limpeza, desinfecç ão e esterilização de materiais e instrumentais são de extrema importânc ia17 , 3 8 , 5 1 , 5 9.
Contudo, outras medidas c omplementares devem s er adotas, tais como a desinfecção de próteses por meio de soluções desinfetantes34, a desinfecção de moldes 12 , 1 9 , 2 6 , 3 0 , 3 9 , 4 3 , 45 , 4 8, 5 3 , 6 3, 68 e modelos dentários
em gess o 1, 2 , 6 , 9 , 1 0, 1 2 , 1 3, 2 7 , 2 8, 3 5 , 3 6, 4 9 , 5 0 , 5 1 , 54 , 5 5 , 5 6 , 5 8, 6 1 , 6 4, 67.
Na prática odontológica, a des infecção de moldes, nem sempre é realizada6 7 e alguns materiais de moldagem que pos suem
características hidrofílicas podem sofrer alteraç ões dimensionais quando em c ontato com s oluções aquosas des infetantes8 , 3 1, 3 6. Sendo
assim, a desinfecç ão de modelos de gesso pode ser uma opção v iáv el para prev enir a infecção cruzada1 3, 5 6.
Além disso, foi obs ervado que microorganismos patogênicos podem s er enc ontrados em modelos de gesso separados de moldes contaminados, fazendo c om que ess es modelos sejam fontes potenciais de infecção cruzada3 3 , 4 0.
Entre as formas de desinfecção de modelos de gesso, estão a utilizaç ão de desinfetantes incorporados à massa do gess o56, a
desinfecção atrav és de imersão2 , 9, 27 , 4 0, 48 , 4 9, 5 0 , 5 1, a desinfecção por meio
de spray6 1 e a incorporação de soluções des infetantes durante a
Um fator importante a s er c onsiderado é o efeito
antimic robiano dos agentes desinfetantes utilizados para a des infecção dos modelos de gess o.
Na literatura, a maioria dos estudos sobre esse efeito
antimic robiano está relacionada a soluções desinfetantes incorporadas ao gesso durante sua manipulação6 , 2 8, 3 6 , 6 4, 6 7.
As soluções desinfetantes, mais citadas são o hipoclorito de sódio1 , 1 3 , 2 8 , 3 6, 54 , 5 5, 5 8 , 6 4 e o glutaraldeído1, 2 8 , 3 6, 5 8 , 6 4. Entretanto, outras
soluções podem s er des tinadas para tal fim, como a soluç ão de digluconato de clorexidina6, 1 0 , 2 8, 3 5.
A c lorexidina é uma bisguanida c atiônica1 1 , 20 , 3 7 , 4 1 que poss ui
ativ idade antimicrobiana de amplo espec tro para microorganismos gram positiv os e gram negativ os, fungos, incluindo a Candida
albicans11 , 1 5 , 1 6 , 2 0 e também sendo efeti va para alguns v írus1 5. Quando
usada em altas e baixas concentrações, tem propriedades bac tericidas e bacteriostátic as, respectiv amente1 5, 4 1.
Há mais de v inte anos , a clorexidina é us ada na periodontia e endodontia dev ido às suas propriedades antimicrobianas e s ua baixa citotoxic idade5 , 5 7, 6 9. Também pos sui eficácia em baixas concentrações
e substantiv idade que prolonga seu efeito terapêutico no meio bucal, mínima absorção a partir do trato gas trointestinal e reduz a formaç ão de placa bacteriana2 0.
Amorin et al.5, em 2004, relataram que a clorexidina mantém a capacidade de desinfecção após contato com matéria orgânica, ao contrário do hipoclorito de s ódio, além de s er menos tóxic a69. Sua ação
primária é a quebra da membrana citoplasmática6 2, dev ido à sua capacidade de se ligar à superfície da membrana c elular e produzir alterações na permeabilidade desta membrana, resultando na perda de componentes intracelulares e na prec ipitação e c oagulação do
conteúdo c itoplasmático3 7.
A c lorexidina é mais comumente utilizada na forma de
digluconato de clorexidina, mas também possui outros deriv ados como cloridrato de clorexidina42. Este é um antimicrobiano de amplo
espectro, com alta ativ idade para E. coli, Salmonella spp.,
Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, pseudomonas spp.,
entre outros42. É utilizado em raç ões de av es e suínos para melhorar a
absorção de nutrientes e como c onservante em produtos cosméticos4 2.
As sim, este es tudo tev e como objetiv o av aliar a ativ idade antimic robiana da solução de digluconato de clorexidina 2% e do cloridrato de clorexidina 98% incorporados ao gesso tipo IV durante sua manipulação, para 4 microorganismos (Staphylococcus aureus, Bacillus s ubtilis, Escheric hia coli e Candida albic ans).
O grupo 1, no qual o gesso foi manipulado somente com água destilada esterilizada, foi considerado o controle pos itiv o. E, de acordo com os res ultados, não apresentou atividade antimicrobiana nos dois períodos de anális e para todos os microorganismos testados, estando de acordo com Arioli Filho6 ao afirmar que o gesso odontológico tipo IV da marca Fuji Rock não possui, em sua composição, elementos
químicos que fav oreçam a desinfecç ão. Es tes resultados também
confirmam as observações de Leung, Schonfeld33 e de Mitchell et al.4 0,
de que se o molde não for desinfetado o modelo de gess o obtido torna- se um meio potencial de infecção cruzada.
Entretanto, resultados diferentes foram encontrados por Mansfield, White36 e por Iv anovski et al.2 8, nos quais o gesso
manipulado pela forma padrão apresentou alguma ativ idade antimic robiana até 24 horas após s ua manipulação. Segundo os autores2 8, cada microorganismo foi afetado pelo gesso ou eles são
incapazes de sobreviver por 24 horas nos modelos. Além disso, fatores inerentes do gesso, como o c alor liberado durante sua cristalização, a desidratação e o efeito do sal (CaSO4) podem ter afetado s eu
crescimento bacteriano3 6.
Es sa oposiç ão de resultados pode ser explicada pelas
diferenças de formulações do gesso de acordo c om a marca comercial. Compostos diferentes produziriam propriedades diferentes. Mas estes compostos normalmente não são identific ados, já que a fiel composiç ão química do gesso constitui um segredo industrial6.
No grupo 2, os c orpos-de-prov a eram discos de papel filtro embebidos com s olução de digluconato de clorex idina 2%, sendo
considerados um controle negativ o, com o objetiv o de av aliar o máximo de ativ idade antimicrobiana desta solução desinfetante sem estar
assoc iada ao gess o odontológic o. Os resultados demons traram que a solução de digluconato de clorexidina 2%, quando não incorporada ao gesso odontológico, possui ativ idade antimicrobiana para todos os microorganis mos analisados. Este resultado es tá de acordo com o estudo de Estrela et al.2 2, no qual a solução de digluconato de clorexidina 2% foi efetiv a para vários microorganismos incluindo
Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis e Candida albicans .
A s olução de digluconato de clorex idina 2% incorporada ao gesso odontológico tipo IV (grupo 3) demonstrou ativ idade
antimic robiana nula somente para a Candida albicans. Um resultado negativ o para a solução de clorex idina também foi obtido por Iv anovski et al.2 8, no qual es ta s olução foi ineficaz para a maioria dos
microorganis mo testados, incluindo a C. albicans . Porém, é importante enfatizar que a concentração da solução de clorexidina usada no
estudo de Iv anovski et al.2 8 foi de 0,2% e os próprios autores afirmaram
que estudos posteriores dev em ser realizados com concentraç ões mais altas.
De ac ordo c om a literatura5, a c lorexidina, para ter efeito
sobre a Escherichia coli, precisa de uma concentraç ão inibitória mínima menor do que aquela necess ária para ter efeito sobre o Staphylococcus
aureus e à Candida albic ans. Talv ez, es te seja um dos motiv os para
que mic roorganismos facultativ os como o Staphylococcus aureus e mes mo a Candida albicans , s ejam considerados, por muitos , as espécies mais resistentes na cavidade oral6 9.
Jennings , Samaranayake3 0, e m 1991, afirmaram que fungos como a Candida albicans são microorganismos robustos e
consideravelmente mais difíceis de sofrerem ação de agentes desinfetantes do que vírus.
Na literatura é estabelecido que as c élulas de Candida
albicans possam exibir relativ os nív eis de resistênc ia fenotípica à
clorexidina62. De ac ordo com Suci, Tyler6 2, a resis tência fenotípica
refere-se à diminuição da susceptibilidade de um microorganismo a um agente antimicrobiano. Isto ocorre com a Candida albicans dev ido a mudanç as na composição da s ua membrana lipídica6 2. Porém, este
mecanismo de resis tência ainda não é bem compreendido1 1.
Embora, os resultados des te presente estudo sugiram que a solução de clorexidina é ineficiente para a Candida albic ans, alguns autores têm afirmado o c ontrário6 , 2 0 , 2 2 , 3 7 , 57.
Es tudos com soluções irrigadoras de canais radic ulares têm demons trado que a clorexidina é eficiente para C. albicans5 , 7 , 2 3, 5 7.
Entretanto, ao as sociá-la a outra substância o efeito pode não ser o mes mo, como o que foi v erific ado no estudo de Siqueira et al5 7, em 2003, no qual, a ass ociação da solução de digluconato de c lorexidina 0,12% com o hidróxido de cálc io não foi efetiv a para Candida albicans, até mes mo depois de uma semana de exposição ao medicamento; o que segundo os autores foi dev ido à inibição do efeito da clorexidina pelo hidróxido de cálcio.
A ativ idade antimicrobiana da clorexidina é pH dependente, tendo sua melhor ação com pH entre 5,5 e 7,01 1, portanto, sua
assoc iação com substânc ias como o hidróxido de cálcio ou com o sulfato de cálcio do gess o poderia alterar s ua efetiv idade
antimic robiana. Entretanto, de ac ordo c om Arioli Filho6, a mistura do
digluconato de clorexidina ao gesso odontológico é v iável porque o sulfato de cálcio hemihidratado proporc ionaria um pH mais fav oráv el para a sua desinfecção.
Cabe s alientar também que, neste presente estudo, a
concentraç ão do inóculo foi aprox imadamente 15 X 108 cfu/mL com o objetiv o de proporcionar uma condiç ão de contaminação mais sev era. Esta concentração é bem maior que as concentrações utilizadas em outros estudos8, 1 6 , 2 2, 2 3 , 3 0, 3 6 , 3 7 , 4 1, o que, s egundo Amorin et al.5, pode
influenciar a interação entre microorganismos e agentes des infetantes causando discrepânc ias em tes tes de sensibilidade antimicrobiana.
Ainda em relação aos res ultados obtidos para a Candida
albicans, o cloridrato de clorexidina 98% incorporado ao gesso tipo IV
(grupo 4) apresentou ativ idade antimicrobiana nos dois períodos de análise, não hav endo diminuição de um período para o outro. Tal efetiv idade pode ser justificada pelo fato do cloridrato ser um pó não solúv el em água4 2 e possiv elmente apresentar partículas na s uperfíc ie
da mass a do gesso, oc orrendo um contato direto com o
microorganis mo. Porém, sua ativ idade antimicrobiana foi menor que a do controle negativ o (P<.05). Mes mo assim, pode-se afirmar que a assoc iação do cloridrato ao gesso tipo IV pode ser uma opção antimic robiana para C. albicans.
Em relação ao Staphyloc occus aureus , Bac illus subtilis e Escherichia c oli, os agentes desinfetantes tes tados neste es tudo demons traram ativ idade antimicrobiana nos dois períodos de anális e. Estes resultados são concordantes com os de Arioli Filho6, em 2006,
nos quais o digluconato de clorexidina 2% apres entou atividade antimic robiana até o 17° dia de anális e.
A ativ idade antimic robiana do cloridrato de clorex idina 98% incorporado ao gesso odontológic o testado (grupo 4) foi v ariável, sendo maior ou menor que a ativ idade do digluc onato de clorexidina 2%,
dependendo do microorganismo analisado. Estes res ultados podem estar relacionados a diferenças entre os s ais da clorexidina e entre suas formulações (o digluc onato de clorexidina foi utilizado na forma de solução e o cloridrato na forma de pó), além de apresentarem
solubilidades e conc entrações diferentes16.
No geral, não houv e interação estatística entre os agentes desinfetantes e os períodos de análise, demons trando que a ativ idade antimic robiana se mantev e constante até 24 horas após o vazamento do gesso, o que é muito importante, já que es te é o período onde os modelos são mais manipulados pela equipe do laboratório de prótes e e do consultório odontológico2 8. A ex ceção foi a Escherichia coli, na qual
o controle negativ o (grupo 2) no período de análise de 24 horas foi menos efetiv o do que no período de 1 hora.
É importante enfatizar que apesar do teste de difusão em Agar demons trar se um agente desinfetante possui ou não ativ idade
antimic robiana, não é possív el distinguir esta ativ idade como sendo bactericida ou bacteriostática8.
De ac ordo c om os resultados obtidos nes te presente estudo, dos dois agentes desinfetantes testados, o c loridrato de clorexidina 98% parece ser uma possibilidade eficiente e de fác il execução no combate à infecção cruzada entre o ambiente clínico e laboratorial; uma v ez que o cloridrato poderia ser incorporado ao gesso
odontológic o durante a fabricação des te último, garantindo ao ges so uma propriedade antimicrobiana independentemente da utilização de algum procedimento de des infecção adotado por c irurgiões-dentistas ou pelos técnicos em prótes e, antes, durante ou após o vazamento dos modelos de gesso.
Entretanto, mais estudos s ão necess ários para se av aliar a ativ idade antimicrobiana dos agentes des infetantes deriv ados da clorexidina quando incorporados ao gesso odontológico durante sua manipulação bem c omo as poss íveis alterações geradas nas
7 CONCLUSÃO
Dentro das limitações des te estudo in v itro, pode-s e concluir que:
1. A solução de digluconato de clorexidina 2% incorporada ao