Granskingsmetoder og prosesser

4.2.1 Características Químicas e Atividades Farmacológicas do Extrato Polissacarídico de Sabugo de Milho (EPSM)

Para a obtenção do extrato polissacarídico de sabugo de milho (EPSM) foi aplicada uma metodologia de extração que emprega solução alcalina e ondas de ultrassom. O rendimento médio para extração do EPSM foi de aproximadamente 43%. Após caracterização química parcial foi observado que mais da metade da massa obtida (60%) depois da extração era constituida por açúcares, com um baixo índice de contaminação por proteínas (0,4%) e compostos fenólicos (<0,01%). A composição monossacarídica foi determinada e a seguinte razão do percentual molar do EPSM foi obtida: xilose (50%): glicose (20%): arabinose (15%): galactose (10%): manose (2,5%): ácido glucurônico (2,5%). Estes dados foram adquiridos através da técnica de cromatografia descendente de papel, e confirmados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Além disso, o extrato polissacarídico foi submetido a análises por espectroscopia de infravermelho e ressonância magnética nuclear (RMN-H1 e RMN- C13). O espectro de infravermelho da região entre 4000-500 cm-1 revelou sinais típicos de heteroxilanas e grupamentos carboxílicos presentes em ácidos glucurônicos. Os espectros de RMN evidenciaram sinais característicos de resíduos de α-arabinoses compondo cadeias laterais que estão ligadas aos resíduos de xiloses. Ainda foram identificados sinais correspondentes ao ácido glucurônico e 4-O-metil-glucurônico como também sinais típicos de resíduos de manose (SILVEIRA, 2010).

Os açúcares presentes no EPSM mostraram atividade antioxidante em ensaios in vitro. Após realização do ensaio de capacidade antioxidante total (CAT), o resultado de 48,45 mg EAA/g (equivalante de ácido ascórbico por grama de amostra) inspirou a realização de outros ensaios antioxidantes para avaliar o mecanismo de ação antioxidante. Os polissacarídeos presentes no EPSM não mostraram atividade no ensaio de sequestro de radical hidroxila e superóxido, como também não apresentaram atividade no ensaio de poder redutor. Por outro lado, o EPSM mostrou atividade quelante de íons ferrosos (Fe2+) e cuprosos (Cu2+) nos ensaios antioxidantes in vitro. Com relação à capacidade de quelar os íons de ferro, o EPSM apresentou um efeito quelante de aproximadamente 50% quando utilizada uma concentração de 0,25 mg/mL. A ação quelante foi dose-dependente e alcançou uma atividade máxima em torno de

90% na concentração próxima a 0,5 mg/mL do extrato. A capacidade de quelação de íons Cu2+ do EPSM se apresentou de forma distinta da quelação férrica. Neste caso, uma atividade máxima de aproximadamente 65% foi atintigida com uma concentração 2,5 vezes menor (0,1 mg/mL) que a aplicada no teste de quelação férrica. Além disso, essa habilidade quelante de íons cuprosos não foi alterada com o aumento da concentração do extrato aplicado ao ensaio.

Como a atividade anticoagulante é sempre cogitada quando se trabalha com polissacarídeos de fontes naturais, o EPSM foi avaliado quanto a sua capacidade em alterar o tempo normal de coagulação sanguínea. Com relação ao ensaio de PT (tempo de protrombina) a amostra não mostrou atividade anticoagulante estatisticamente significativa. Entretanto, com relação ao ensaio de APTT (tempo de tromboplastina parcial ativada), o EPSM foi capaz de prolongar o tempo normal de coagulação em cerca de 5 vezes, e esse efeito foi dose-dependente (de 0 a 600 µg da amostra). Em adição, quando as carboxilas dos ácidos urônicos do polissacarídeo de EPSM foram reduzidas por reações químicas de carboxirredução, verificou-se uma redução de 4 vezes o potencial anticoagulante original dos polissacarídeos do EPSM no ensaio de APTT (MELO-SILVEIRA et al, 2012; SILVEIRA, 2010).

4.2.2 Avaliação in vitro da atividade antiproliferativa do EPSM frente a diferentes linhagens celulares

Para avaliação da atividade antiproliferativa do extrato, distintas linhagens celulares tumorais e normais foram cultivadas na presença de diferentes concentrações do EPSM. Os resultados da influência do extrato na proliferação celular em condições de cultura são expressos na figura 11.

As células normais da linhagem fibroblástica 3T3 (fibroblastos murínicos) não foram afetadas quando incubadas com EPSM em nenhuma das concentrações utilizadas (Figura 11). Já as células HeLa (células tumorais de colo uterino humano) tiveram uma diminuição de sua proliferação de maneira dose-dependente. Com uma concentração de 0,1 mg/mL do EPSM, ocorreu uma redução de aproximadamente 40% na taxa de proliferação das células tumorais em cultura. A máxima redução no índice de proliferação celular da HeLa alcançou valores próximos a 60% quando aplicada uma concentração de 1,0 mg/mL do extrato.

Além das células HeLa e 3T3, uma linhagem tumoral de adenocarcinoma de epitélio basal alveolar (A549), e duas linhagens de células normais, sendo uma de macrófagos/monócitos murínicos (RAW 264.7) e outra de células do ovário de hamster chinês (CHO) foram usadas no ensaio. As células RAW 264.7 e CHO tiveram suas taxas de proliferação modificadas na presença do EPSM. De forma dose-dependente, a presença do extrato aumentou os índices de proliferação dos macrófagos. Com uma concentração de 1,0 mg/mL do EPSM o valor de proliferação celular da RAW 264.7 foi 11% maior do que a observado no grupo controle negativo, esse valor chegou ao máximo de 33% acima do valor encontrado com o grupo controle quando aplicado cerca de 2,0 mg/mL do EPSM. Dentre todas as linhagens utilizadas, as células normais CHO foram as que tiveram maior aumento no índice de proliferação celular quando

cultivadas na presença do EPSM, e esse efeito indutor ficou mais evidente com o aumento das concentrações utilizadas de EPSM. Ao ser aplicado 0,1 mg/mL do extrato, a proliferação das células ovarianas ficou 12% acima dos valores encontrados com o grupo controle. Quando uma concentração de 0,5 mg/mL foi usada, o índice subiu para cerca de 20%, e atingiu o efeito máximo de aproximadamente 43% com 1,0 mg/mL da amostra. Por outro lado, no que diz respeito às células tumorais A549, a sua taxa de proliferação foi inibida devido à presença de EPSM, mas os valores de inibição não aumentaram em correspondência ao aumento das concentrações do extrato. Um valor máximo de inibição em torno de 20% foi atingido já com a menor concentração utilizada, 0,1 mg/mL do EPSM, e o índice foi constante mesmo com o aumento das concentrações de EPSM. Esses resultados revelaram que os compostos presentes no EPSM induzem respostas diferentes quanto a promoção da proliferação celular, e que a resposta das células ao extrato depende da origem tecidual dessa linhagem.

Figura 11 – Efeito do EPSM relacionado à proliferação de células em cultura. Foram

testadas diferentes concentrações da amostra frente a distintas linhagens celulares tumorais e normais. Linhagens de células tumorais: Células humanas de câncer cervical (HeLa); Células humanas de adenocarcinoma de epitélio basal alveolar (A549). Linhagens de células normais: Fibroblastos murínicos (3T3); Macrófagos/monócitos murínicos (RAW 264.7); Células de ovário de hamster chinês (CHO). a,b Letras diferentes indicam diferenças significativas entre as diferentes concentrações utilizadas na mesma amostra. x,y,z Letras diferentes indicam diferenças significativas entre as concentrações similares utilizadas em diferentes linhas celulares. Teste de Student-Newman-Keuls (p <0,05). n = 3.

Com base nos resultados da figura 11, as células da linhagem HeLa foram escolhidas como modelo para compreensão do processo de morte celular induzida pelo EPSM. HeLa A549 3T3 RAW 264.7 CHO