Funksjoner

O uso de camundongos em pesquisa biomédica contribuiu muito para o entendimento da hematologia de mamíferos, demonstrando muita similaridade com humanos. Assim, ao se avaliar um determinado tratamento em camundongos, os valores hematológicos devem ser considerados, sendo essencial a existência de um grupo controle, com animais sadios, utilizado na comparação primária dos dados, além dos valores de referência que também ajudam na interpretação dos resultados (EVERDS, 2007).

Na avaliação de toxicidade aguda do Experimento 1, em que foram administradas as doses mais elevadas dos três experimentos, os tratamentos com Rh2Cit, Magh-Rh2Cit e Magh-Cit em camundongos sem carcinoma mamário não resultaram em alteração do eritrograma em relação ao grupo sadio, no período de 48 horas (Tabela 10). A concentração de Rh2Cit aplicada foi de 14,1 mg/kg, quase dez vezes maior do que a total utilizada ao longo do Experimento 2 (1,5 mg/kg divididos em três aplicações de 0,5 mg/kg).

Com base nesses dados, pode-se supor que, em relação ao grupo sadio, foi a presença do tumor, e não os tratamentos, a responsável pela redução significativa na concentração de hemácias de animais tratados com Rh2Cit (Experimento 2) e com Magh-Cit (Experimento

3) (Tabelas 11 e 12). Essa alteração não foi suficiente, contudo, para ocasionar anemia já que

os valores da concentração de hemácias ainda se mantiveram nos padrões dos valores de referência descritos na literatura (7,3-10,5 x 106) (VIANA, 2007). No Experimento 3, os camundongos portadores de tumor do grupo controle e tratados com Magh-Cit apresentaram diminuição significativa na concentração de hemoglobina, embora este valor também não tenha sido suficiente para causar anemia, já que está de acordo com o descrito por VIANA (2007) (12-15 g/dL). Entretanto, os hematócritos do grupo controle e dos tratados com Rh2Cit e Magh-Cit apresentaram redução significativa em relação ao dos animais sadios, estando abaixo do intervalo descrito para os valores de referência (35-50%) (VIANA, 2007). Tal fato pode estar relacionado ao desenvolvimento do câncer, já que o crescimento do tumor ocasiona hemorragias, alterando o volume dos glóbulos vermelhos no sangue (GOLDSHTEIN et al, 2010). Nas secções histopatológicas dos tumores essas regiões hemorrágicas estão próximas a áreas de necrose, possivelmente em virtude de hipóxia (Figuras 33 A, 34 A, 35 A e 36 A).

Assim como a redução do número de eritrócitos pode ocasionar anemia, a deficiência de ferro também pode levar a esta condição. O ferro, principal constituinte da hemoglobina, é

transportado associado à transferrina na forma de ferro sérico (EVERDS, 2007; WANG et al, 2010). Este foi dosado para avaliar se houve alguma alteração de sua concentração no organismo devido à presença do tumor ou aos tratamentos com NPs de maghemita. A menor concentração de ferro sérico observada no sangue dos animais dos grupos controle e Rh2Cit (Experimento 2) (Tabela 8) e controle e Magh-Cit (Experimento 3) (Tabela 9) deve-se, provavelmente, à redução significativa do número de eritrócitos dos respectivos grupos (Tabelas 11 e 12). No Experimento 1, entretanto, houve aumento dos valores de ferro sérico dos animais tratados em relação ao do grupo sadio. Ainda assim, a concentração de ferro obtida dos animais tratados permaneceu próxima a 160 µg/dL, valor já observado anteriormente para camundongos BALB/c (MENCACCI et al, 1997).

A avaliação de parâmetros bioquímicos do soro é fundamental para identificar a possível ocorrência de toxicidade, induzida por uma nova droga, e deve ser correlacionada com testes histopatológicos (RAMAIAH, 2007). Injúrias hepáticas compõem mais de 50% das manifestações de toxicidade causadas por agentes químicos (SCHEARS, 2003), representando o maior obstáculo para o desenvolvimento de novas drogas (CULLEN & MILLER, 2006). A transaminase glutâmica pirúvica (TGP), também chamada glutamato- piruvato transamiase ou alanina aminotrasferase (ALT), é detectada no soro sanguíneo e pode ser utilizada no diagnóstico de lesões hepáticas provocadas por drogas tóxicas ou por infecções (NELSON & COX, 2006). Nesse sentido, níveis de TGP aumentados indicam toxicidade ao fígado (hepatotoxicidade), relacionada à necrose de hepatócitos e à inflamação (CENTER, 2007). Observou-se no Experimento 1, sem implante tumoral, e nos

Experimentos 2 e 3, com animais portadores de carcinoma mamário, que não houve

aumento dos níveis de TGP. Frente a esse parâmetro hematológico, pode-se sugerir ausência de hepatotoxicidade.

Contudo, pela avaliação histopatológica do fígado verificou-se que as médias do IAH (índice de alteração histopatológico) de todos os grupos tratados nos Experimentos 1, 2 e 3 apresentaram aumento em relação aos animais sadios, estando dentro do intervalo 21-50. Segundo Langiano e Martinez (2008) valores de IAH neste intervalo estão relacionados à presença de alterações hepáticas que variam de moderadas a fortes. Nesse sentido, os tratamentos realizados nos três experimentos podem ter induzido alterações no fígado dos camundongos, principalmente no grupo tratado com Magh-Rh2Cit, em que se obteve o maior IAH. O aumento no valor de IAH no fígado de animais tratados pode estar relacionado com a presença de infiltrado inflamatório, observado próximo aos vasos sanguíneos, principalmente junto a NPs (ABDELHALIM & JARRAR, 2012).

(superior a 100) do grupo controle demonstrou que a presença do tumor provocou alterações histopatológicas irreversíveis. Isso foi corroborado pela análise morfométrica, em que houve aumento significativo do volume e da área nuclear de animais do grupo controle em relação ao sadio, no Experimento 2 (Tabela 24), e do diâmetro nuclear, no Experimento 3 (Tabela

25). Desse modo, pelas análises morfométricas, verificou-se que a hipertrofia hepática foi

devido à presença do tumor e não aos tratamentos. Embora a avaliação qualitativa do IAH tenha demonstrado danos, de moderados a fortes, causados pelos tratamentos, as análises morfométricas e bioquímicas do TGP sugerem baixa hepatotoxicidade. Além disso, apesar de algumas regiões do fígado terem sido lesadas, o órgão como um todo, possivelmente, não perdeu sua função, devido à multiplicação de células saudáveis.

A depuração de substâncias exógenas administradas ao organismo é realizada nos rins, o que torna a função renal um indicativo de toxicidade. Devido à velocidade constante de excreção de creatinina, a sua concentração no sangue é um excelente parâmetro para determinar a taxa de filtração glomerular e, deste modo, relacionar com a possível nefrotoxicidade causada pelos tratamentos realizados. Quando um determinado composto causa toxicidade renal há uma redução na velocidade de filtração glomerular e consequente decaimento da excreção urinária de creatinina, resultando em aumento do seu nível no sangue. Assim, valores crescentes de creatinina sérica indicam nefrotoxicidade (MOTTA, 2003).

Pela avaliação da toxicidade aguda, realizada no Experimento 1, e pelas análises toxicológicas dos Experimentos 2 e 3, com implante tumoral, não se observou aumento significativo de creatinina no sangue de nenhum animal tratado em relação aos sadios (Tabelas 7, 8 e 9). Com base nesse parâmetro bioquímico, as amostras utilizadas durante os tratamentos não promoveram toxicidade renal, já que a deficiência da filtração glomerular deve-se ao aumento da concentração de creatinina no sangue. Segundo Motta (2003), teores diminuídos de creatinina não apresentam significado clínico. Isto sugere que a redução significativa nos níveis de creatinina de animais portadores de tumor do Experimento 2 não possui relevância biológica.

A coleta de urina de animais para fins científicos é muito comum para avaliar determinados parâmetros fisiológicos. Camundongos e ratos são os mamíferos mais utilizados em testes de toxicidade aguda e crônica e em avaliações pré-clínicas de drogas e agentes químicos. Nesse sentido, avaliações da urina são importantes para investigar a função renal, a excreção de xenobióticos e de seus metabólitos e a existência de anormalidades endócrinas ou

metabólicas (KURIEN et al, 2004). A importância em se avaliar a cor e o aspecto da urina deve-se a possíveis alterações causadas pelos tratamentos, sendo o padrão normal amarelo citrino com aspecto límpido. A densidade é utilizada para identificar a capacidade do animal em concentrar a urina. Assim, a liberação normal do hormônio antidiurético (ADH) e a presença de população suficiente de néfrons e de túbulos funcionais que respondam ao ADH são fatores responsáveis por manter uma determinada concentração de solutos na medula renal que resulte em uma densidade próxima a 1010. Além do funcionamento renal, a densidade reflete o uso de medicamentos, intoxicações e infecções (BICALHO & CARNEIRO, 2012).

O exame da urina obtida dos camundongos do Experimento 1 (sem implante tumoral) contribuiu com a análise de creatinina sérica, corroborando o bom funcionamento renal, já que a densidade urinária de todos os grupos foi de 1010. Os resultados da urina de animais tratados com Rh2Cit, Magh-Rh2Cit e Magh-Cit foram bastante semelhantes aos do grupo sadio, havendo divergência apenas no valor do pH de animais tratados com 14,1 mg/kg de Rh2Cit. Neste grupo, observou-se pH com valor aumentado em relação ao do grupo sadio, havendo, ainda, a formação de precipitados de fosfatos em dois animais, comum em urina alcalina. Também foi verificada a formação de fosfato triplo nos camundongos dos grupos Magh-Rh2Cit e Magh-Cit, embora os valores de pH por eles apresentados não tenham divergido estatisticamente ao dos animais sadios. Em relação à taxa de glicose na urina, observou-se que apenas um animal do grupo sadio apresentou alta concentração (500 mg/dL). Tal fato pode estar associado à alimentação, uma vez que os animais não foram submetidos a jejum antes da coleta da urina. Os demais camundongos apresentaram níveis de glicose compatíveis com os valores de referência (50 a 190 mg/dL) (VIANA, 2007), o que sustenta a proposta de ausência de toxicidade renal pelos tratamentos. A reabsorção da glicose para o sangue depende do correto funcionamento dos túbulos renais, o que não permite o excesso de glicose na urina. Verificou-se, ainda, diminuição significativa de células epiteliais do grupo Magh-Rh2Cit em relação aos grupos Rh2Cit e Magh-Cit sem, contudo, apresentar diferença em relação aos animais sadios, indicando descamação normal das células do trato urinário.

A contagem de plaquetas no sangue consiste em exame de rotina laboratorial, incluído no hemograma automatizado, sendo que aumentos e diminuições do volume plaquetário podem estar relacionados a determinadas patologias. A plaquetopenia ou trombocitopenia é a redução do número de plaquetas no sangue e pode estar relacionada com tratamentos químicos. A padronização do valor de referência para o volume plaquetário não apresenta consenso na literatura, o que cria a necessidade de um grupo sem tratamento para comparar os

NAMDEV et al, 2009). Assim, ao comparar a concentração plaquetária do sangue de camundongos do grupo sadio, verificou-se redução significativa apenas no Experimento 3, nos animais portadores de carcinoma mamário dos grupos controle, Rh2Cit e Magh-Cit (Tabela 15). Possivelmente, essa redução do número de plaquetas está relacionada à presença do tumor, e não aos tratamentos, levando-se em consideração que o grupo controle, sem tratamento, também apresentou menor quantidade.

O leucograma consiste na avaliação dos leucócitos, também denominados glóbulos brancos, incluindo o total de células e a quantificação relativa de cada tipo de leucócito. Dentre estes, o mais abundante no sangue periférico dos camundongos é o linfócito, correspondendo a ¾ do total, sendo o neutrófilo o segundo tipo mais comum. Os dados de percentagem relativa de linfócitos constituem significado limitado, sendo importante a contagem absoluta dessas células. A quantificação de leucócitos em camundongos varia muito entre laboratórios, de 2000 a 10000/mm3 de sangue (EVERDS, 2007).

Na avaliação de toxicidade aguda realizada no Experimento 1, não se observou diferença estatística dos valores do leucograma de camundongos tratados em relação aos sadios. Em contrapartida, houve aumento na percentagem de Neutrófilos + Monócitos dos grupos Magh-Rh2Cit e Mag-Cit em relação ao Rh2Cit (Tabela 16). Tal fato não deve possuir relevância biológica, pois a quantidade dessas células não ultrapassou os valores de referência (30%, VIANA, 2007).

A presença de carcinoma mamário nos camundongos dos Experimentos 2 e 3 refletiu em diminuição e aumento significativos da percentagem de linfócitos e neutrófilos, respectivamente (Tabelas 17 e 18). Isto pode estar relacionado com a resposta do sistema imune às células tumorais, provocando maior produção leucocitária e consequente aumento do baço (esplenomegalia) (Figura 17), já que esse órgão tem função secundária na produção de leucócitos. Os neutrófilos tiveram produção muito aumentada em ambos os experimentos com implantação tumoral, ultrapassando em mais de 20 vezes a concentração obtida dos animais sadios (Tabelas 17 e 18), estando elevada, também, em relação ao valor de referência descrito por Nemzek et al, (2001) (5700/mm3±0,4). Em relação à concentração absoluta de linfócitos, não se observou diferença significativa de seus valores em relação ao grupo sadio em nenhum dos dois experimentos, embora tenha havido um acréscimo dessas células em animais portadores de tumor no Experimento 3 (Figura 19). Os valores das demais células descritas no leucograma (eosinófilos e monócitos) não apresentaram diferenças estatísticas em relação ao grupo sadio no Experimento 2. Já para o Experimento 3, o valor de eosinófilos de

animais tratados com Magh-Cit foi aumentado, embora ainda esteja dentro do intervalo de referência (1 a 3%, VIANA, 2007), sugerindo que os tratamentos utilizados pouco interferiram no metabolismo desses glóbulos brancos.

A histopatologia do pulmão contribuiu com as análises do leucograma em virtude do que foi verificado nos vasos entre alvéolos pulmonares. No Experimento 1, sem implante de células tumorais, observou-se baixa concentração leucocitária no interior dos vasos de todos os grupos, não demonstrando processo inflamatório em virtude dos tratamentos. Além disso, a presença de linfócitos nos vasos, em detrimento de neutrófilos, foi passível de identificação (Figura 20) corroborando os dados do leucograma do Experimento 1 (Tabela 16). Todavia, nos Experimentos 2 e 3, assim como nos respectivos leucogramas, foi observado um aumento na concentração leucocitária nos vasos da parede alveolar de animais portadores de carcinoma mamário. A presença de linfócitos foi destacada nos grupos sadios dos dois experimentos em relação à quantidade existente nos grupos com tumor. Nestes, houve aumento perceptível no número de neutrófilos em relação ao de linfócitos (Figuras 21 e 22). Além disso, a morfologia pulmonar mostrou-se sem alteração em todos os grupos dos

Experimentos 1, 2 e 3, com espaços alveolares não colabados e sem espessamento dos septos

interalveolares. Ainda, o tecido pulmonar de animais tratados com Magh-Rh2Cit e Magh-Cit apresentou NPs no parênquima perivascular e, em grande quantidade, no interior de pequenos vasos sanguíneos, sendo que, nos três experimentos, houve um maior acúmulo de Magh- Rh2Cit do que de Magh-Cit (Figuras 20-22).

A medula óssea é um dos tecidos mais sensíveis a agentes citotóxicos devido a sua rápida taxa de renovação celular. Estudos com animais de laboratório mostraram que é possível identificar toxicidade na medula óssea em níveis de exposição que não causariam outros sinais de toxicidade (NIH, 1993; MALERBA et al, 2002). Assim, na avaliação biológica de um composto químico, a mielotoxicidade deve ser considerada, já que as células da medula óssea apresentam alto índice mitótico, sendo suscetíveis a compostos capazes de realizar ligações com o DNA, como os carboxilatos de ródio (II) (NIH, 1993; MALERBA et

al, 2002, ANGELES-BOZA et al, 2006; CARNEIRO, 2011). Nesse sentido as células da

medula óssea de camundongos tratados com Rh2Cit, Magh-Rh2Cit e Magh-Cit foram avaliadas para verificar os possíveis danos dessas composições ao DNA.

Na avaliação da medula óssea de camundongos portadores de carcinoma mamário do

Experimento 3, apenas os tratados com Magh-Cit apresentaram aumento percentual

significativo de fragmentação de DNA em relação aos grupos sadio e controle. Nos animais tratados com Rh2Cit e Magh-Rh2Cit, verificou-se, respectivamente, redução e aumento não

37). Os resultados referentes aos tratamentos com Magh-Rh2Cit e Magh-Cit foram semelhantes aos descritos por Carneiro (2011), em que essas composições foram administradas localmente no tumor. Entretanto, nos tratamentos com Rh2Cit, o aumento da percentagem de fragmentação de DNA verificada por Carneiro (2011) divergiu do que foi verificado com aplicação via intravenosa. Desta forma, sugere-se que os tratamentos com as formulações nanoparticuladas possam induzir genotoxicidade às células da medula óssea, enquanto que para o Rh2Cit faz-se necessária a realização de outros experimentos que possam corroborar os já realizados.