A adenosina, um nucleosídeo purínico endógeno, está amplamente distribuída pelo corpo, modulando várias respostas fisiológicas nos mamíferos (DAVAL et al., 1996). É produzida por diversos tipos celulares incluindo os fibroblastos, células epiteliais e endoteliais, plaquetas, células musculares, leucócitos, dentre muitas outras, mas também pode ser derivada do metabolismo extracelular de nucleotídeos purínicos (LAPPAS et al., 2005). Sob condições normais, é sintetizada de maneira constitutiva, em pequenas quantidades mas, em locais de dano tecidual é produzida em altas concentrações. Assim, esta molécula desempenha importante papel na regulação da homeostase de muitos sistemas fisiológicos, incluindo cardiovascular, nervoso, renal e sistema imune (BLACKBURN, 2003).
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A adenosina atua como um potente mensageiro extracelular, cuja formação está usualmente elevada na inflamação devido a sua liberação por células pertencentes ou não ao sistema imune (CRONSTEIN, et al., 1985). A liberação alta e rápida de adenosina em resposta aos estímulos nocivos nos tecidos pode apresentar um papel dual na homeostase. Primeiramente, adenosina extracelular atuaria como uma molécula de alarme eminente que sinaliza a presença de tecido lesionado, de forma autócrina e parácrina, para as células ao redor. Em segundo lugar, a adenosina extracelular geraria uma variedade de respostas com ação órgão-protetora, mediando a homeostase.
Um outro fator que contribui para seu aumento extracelular é a rápida degradação de adenosina tri-fosfato (ATP) e adenosina di-fosofato (ADP) em adenosina, principalmente em condições metabolicamente desfavoráveis, tais como hipóxia, isquemia, exercício muscular, trauma, estresse oxidativo ou inflamação (THIEL et al., 2003; OKUSA, 2002; HASKO & CRONSTEIN, 2008). Essa outra via gera sua liberação a partir de precursores nucleotídicos de adenina (ATP, ADP e AMP) que por ação de ectonucleotidases, tais como, CD39 (nucleosídeo trifosfato defosforilase) e CD73 (5’-ectonucleotidase), sofrem catabolismo extracelular (Figura 11) (HASKO & CRONSTEIN, 2004; ZIMMERMANN, 1999).
As moléculas CD39 e CD73 são altamente expressas na superfície das células e são essenciais para a síntese de adenosina durante alguns estímulos lesivos ou estressantes celulares. Tem sido demonstrado que a molécula CD73 é altamente expresso na região apical dos enterócitos e, até o momento, sua única função conhecida é a fosfohidrólise de ATP em adenosina (HASKO & CRONSTEIN, 2004; COLGAN et al., 2014). Achados recentes na literatura demonstraram que essas moléculas são novos marcadores fenotípicos para linfócitos T reguladores (Treg), em que são utilizados para converter o nucleotídeo adenina extracelular em adenosina, a qual geraria uma atividade imunossupressora (BLACKBURN et al., 2009).
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resposta inflamatória sistêmica do hospedeiro direcionada especificamente a patógenos. Esta situação clínica tem como consequência a hipóxia tecidual ocasionada pela distribuição deficiente de oxigênio aos tecidos. Assim, há um comprometimento da energia celular, ocasionando uma quebra intensificada de ATP e elevando-se os níveis de ADP. Este é, portanto, degradado a AMP, levando a um aumento de AMP livre, o qual é desfosforilado em adenosina pela ação da 5’- nucleotidase citosólica (THIEL et al., 2003). Dessa maneira, a adenosina atinge uma alta concentração intracelular sendo, então, transportada para o meio extracelular através de transportadores especializados, para que, assim, possa se ligar a seus receptores específicos localizados na superfície das células (Figura 11).
Figura 11: Metabolismo da adenosina. Esta é formada através seu precursor ATP, tanto no compartimento intra quanto extracelular. A adenosina intracelular é transportada para o meio externo pelo transportador de nucleosídeo. A enzima adenosina quinase pode re-fosforilar
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adenosina a ATP ou a enzima adenosina deaminase (ADA) pode desaminá-la em inosina. Adenosina extracelular pode se ligar a seus receptores - A1, A2A, A2B e A3 - que são expressos na superfície das células do sistema imune (Adaptado de HASKÓ e CRONSTEIN, 2004, TRENDS in Immunology).
Ainda não estão totalmente elucidados, sendo assim interesse de muita investigação, quais tipos celulares estão mais envolvidos na produção de adenosina extracelular. No entanto, CRONSTEIN (1994) relatou que as células endoteliais e os neutrófilos estão sendo consistentemente relacionados com a liberação de grande quantidade de adenosina em sítios de estresse metabólito, inflamação e infecção. Durante o processo inflamatório, uma grande variedade de células, em especial Polimorfonucleares (PMN) e plaquetas, representam uma potente fonte de ATP extracelular e essa produção se dá de forma ativação-dependente (CRONSTEIN, et al., 1985).
Observa-se que vários mecanismos contribuem para o aumento da concentração extracelular de adenosina. No entanto, a sua biodisponibilidade é limitada pela ação de uma das duas possíveis vias: intracelularmente, a adenosina pode ser fosforilada a fim de formar ATP pela enzima adenosina quinase (Figura 11) ou pode ser deaminada pela enzima adenosina deaminase, a qual degrada a adenosina em inosina (Figura 12) (BLACKBURN et al., 2009).
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Figura 12: Representação da reação de deaminação da adenosina em inosina pela enzima adenosina desaminase (ADA). Adaptado de: http://themedicalbiochemistrypage.org/scid.php
A atividade da adenosina desaminase (ADA), no homem, é expressa por duas iso-enzimas: ADA1 e ADA2. A primeira é sintetizada em todos os tecidos e pode ser encontrada livre ou associada ao CD26 (DONG, et al., 1997 e UNGERER, et al., 1996), enquanto que a ADA2 é exclusivamente sintetizada em monócitos e macrófagos (UNGERER, et al., 1996). A ADA exerce um importante papel no controle da concentração de adenosina afetando, desse modo, muitas áreas de modulação extracelular. Assim, a ausência de ADA leva a um descontrole nos níveis de adenosina que consequentemente desencadeará desajustes em uma variedade de cascatas de sinalização da adenosina com consequentes efeitos em muitos sistemas.
O outro substrato da ADA, 2’-deoxiadenosina, é sabido ser citotóxico por interferir com um número de vias metabólicas críticas como por exemplo a ativação da cascata de caspases da apoptose (BLACKBURN et al., 2003). Tem sido relatado que a ADA exerce um importante papel nas reações imuno- inflamatórias agudas, e seu nível sérico tem sido utilizado como um marcador bioquímico para inflamação e doenças (PIRAS et al., 1978; SARI et al., 2003). Trabalhos envolvendo um inibidor da ADA comercialmente disponível (Pentostatin), indicado no tratamento da leucemia de células pilosas vem ganhando destaque. Pentostatin demonstrou eficácia no tratamento da colite
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experimental em camundongos nocautes para IL-10, por causar diminuição na expansão de linfócitos e por reduzir a produção de citocinas pro-inflamatórias (BROWN et al., 2008).
Mais recentemente, dados pesquisados em nosso laboratório mostraram que o EHNA (erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine hydrochloride), um outro inibidor padrão da ADA, induz uma redução nos níveis das citocinas pró- inflamatórias IL-1β e TNF-α e da proteína de fase aguda PTX-3 e induz um aumento nos níveis da citocina anti-inflamatória IL-10 in vivo no modelo de enterite aguda induzida pela TcdA do C.difficile (DE ARAÚJO-JUNQUEIRA et
al., 2011). Além disso, outro trabalho do nosso grupo de pesquisa demonstrou
que o tratamento com fucoidina, um inibidor da infiltração neutrofílica no tecido, reduz a atividade de adenosina desaminase (ADA) (BARRETO et al., 2007).
Dessa forma, muitos pesquisadores acreditam que a inibição da enzima ADA, por aumentar indiretamente a concentração de adenosina extracelular, apresenta um expressivo potencial terapêutico.
1.5 RECEPTORES DE ADENOSINA
A investigação sobre o efeito que a adenosina exerce no processo inflamatório e sistema imunológico pode ser dividida em dois períodos. As primeiras duas décadas deste período demonstraram: a inibição das células envolvidas no processo inflamatório pela adenosina extracelular, implicou como reguladores da inflamação as vias de elevação de Adenosina Monofosfato cíclico (AMPc) e os receptores de adenosina e, enfim, revelou múltiplos estímulos e condições que induzem a liberação da adenosina para o espaço extracelular por diferentes tipos celulares (DEUTICKE et al., 1966; SULLIVAN, et
al., 1976; WINN, et al., 1981; BORN, et al., 1964; LICHTENSTEIN, at al., 1968;
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FREDHOLM, et al., 1982).
As outras duas décadas de investigação caracterizaram-se por pesquisas com síntese de novos ligantes e pela clonagem molecular e caracterização dos quatro subtipos de receptores de adenosina (LINDEN, 2001; LIBERT et al., 1989; OLAH e STILES, 1995; LINDEN et al., 1999).
Fortes evidências apontam a adenosina como uma importante molécula sinalizadora. Todas as células envolvidas no processo inflamatório expressam receptores de adenosina (GESSI et al., 2000; BLACKBURN et al., 2009). A adenosina modula várias respostas fisiológicas em todos os tecidos de mamíferos, por meio da ativação de receptores específicos de superfície celular, denominados receptores de adenosina (FREDHOLM, 1994). Atualmente são conhecidos quatro subtipos de receptores de adenosina: A1, A2A, A2B e A3
(Figura 11). Estes receptores transmembrana, amplamente distribuídos no corpo, fazem parte da família de receptores acoplados à proteína G, que dependendo do tipo de proteína G a qual se ligam, inibem (Gi, G0) ou estimulam
(Gs) a atividade da adenil ciclase (THIEL et al., 2003; LINDEN, 2001). Os
receptores A1 e A3 estão relacionados com proteínas Gi e Go, enquanto que os
receptores A2A e A2B interagem com as proteínas GS, resultando no aumento
intracelular de AMPc (Tabela 1) (OLAH, STILES, 1995; HASKO & CRONSTEIN, 2004).
Tabela 1: Características dos subtipos de receptores de adenosina. Fonte: Adaptado de HASKO & CRONSTEIN, 2004, TRENDS in Immunology.
Inicialmente, acreditava-se que a sinalização gerada pela interação da adenosina com seu receptor levaria a inibição ou estimulação de adenilato
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ciclase (AC), com o concomitante decréscimo ou aumento das concentrações intracelulares de AMPc. Baseado nessa habilidade de diminuir ou elevar a concentração de AMPc, os receptores de adenosina foram inicialmente classificados como A1 ou A2, respectivamente (CRONSTEIN, et al., 1985). Subsequentes estudos que levaram a descoberta de receptores de alta ou baixa afinidade que poderiam ativar a AC, refinaram essa classificação e os receptores A2 foram divididos em grupos: o subtipo A2A, de alta-afinidade, e o subtipo A2B, de baixa-afinidade. Mais recentemente, foi caracterizado o receptor A3, que assim como o A1, é capaz de reduzir as concentrações intracelulares de AMPc (Tabela 1) (HASKO & CRONSTEIN, 2004; AHERNE et al., 2011).
Estes diferentes receptores de adenosina podem exercer efeitos opostos sobre uma mesma função (SITKOVSKY, 2003). Em um estudo CRONSTEIN et
al. (1992) mostraram que a aderência neutrofílica ao endotélio poderia ser
inibida pelos receptores A2A e aumentada por receptores A1. Link et al. (2000) e Bouma et al. (1994) relataram que a secreção de IL-12 por monócitos humanos induzida por lipopolissacarídeo (LPS) foi inibida pelos receptores A2A, mas não pelos receptores A1 ou A3. Assim, o efeito da adenosina sobre um tipo celular irá depender de qual receptor de adenosina se expressa com predomínio sobre a célula e qual o seu grau de afinidade pelo ligante. Sabe-se que os receptores A1 e A2A apresentam alta afinidade enquanto A2B e A3 possuem baixa afinidade pela adenosina (Tabela 1) (HASKO & CRONSTEIN, 2004).
1.6. ADENOSINA E INFLAMAÇÃO
Logo após a descrição dos receptores de adenosina, muitas investigações foram feitas com o objetivo de elucidar a presença desses receptores nos neutrófilos e se esses receptores modulavam as ações neutrofílicas. Os primeiros estudos envolvendo a participação da adenosina sobre estas células remontam da década de 1980. Cronstein e colaboradores
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(1985) reportaram que a adenosina foi capaz de inibir a degranulação e aderência neutrofílica, bem como a geração de radicais óxidos (O-2 e H2O2) por
estas células quando estimuladas com quimioatraentes (C5a ou fMLP - N-formil-
metionil-leucil-fenilalanina) demonstrando que a adenosina desempenha
importante efeito na modulação do processo inflamatório (OKUSA, 2002), correlacionando este nucleosídeo com a inflamação e os estados patológicos.
Nesse mesmo estudo, os autores descreveram que a adenosina poderia interagir em dois tipos de receptores: A1 e A2 (este atualmente classificado como
A2A e A2B). Baixas concentrações de adenosina levaria a ativação do receptor
A1, o qual estimulou a adesão dos neutrófilos às células endoteliais, a quimitaxia
e a fagocitose de antígenos opsonizados. Já em maiores quantidades, a adenosina atuaria via receptores A2, obtendo efeitos contrários nas mesmas
células (CRONSTEIN, et al., 1985).
Trabalhos posteriores confirmaram que a adenosina, agindo sobre seus receptores A2A
e A
2B, inibia algumas funções neutrofílicas tais como, adesão às células endoteliais, atividade bactericida, expressão de moléculas de adesão, secreção de citocinas pró-inflamatórias, fatores de crescimento e síntese de leucotrieno B4 (FLAMED et al., 2000; ANTONIOLI et al., 2008). Os receptores acoplados a uma proteína G, em especial os subtipos A2A e A2B, que sãocapazes de elevar os níveis intracelulares de AMPc, servem como sensores da inflamação e promovem uma resposta de proteção tecidual frente a um estímulo nocivo.
Em humanos, a adenosina, em concentrações nanomolares, é capaz de estimular preferencialmente o receptor A1 em neutrófilos, induzindo a supra- expressão endotelial de P-selectina e dos receptores de complemento, responsáveis pela adesão neutrofílica. Em contraste, concentrações micromolares de adenosina inibe a adesão neutrofílica às células endoteliais via ativação dos receptores A2A e A2B. A expressão e o papel do subtipo A3 em neutrófilos humanos ainda é incerto (ANTONIOLI et al., 2008). Em geral, os efeitos anti-inflamatórios modulados pelos receptores A2A dominam as ações
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pró-inflamatórias dos receptores A1. Assim, quando os neutrófilos chegam no sítio onde há intensa injúria tecidual, a adenosina, gerada em altas concentrações pelo dano celular ou por células, age como um feedback inibitório das funções inflamatórias dos neutrófilos (HASKO e CRONSTEIN, 2004).
As células endoteliais desempenham um papel muito importante na inflamação e na imunidade inata. Estas células expressam moléculas de adesão que são responsáveis pelo recrutamento de leucócitos para os sítios inflamados, bem como também sintetizam e liberam mediadores inflamatórios, como o fator de ativação de plaquetas, IL-8 e IL-6, que exercem um papel direto no processo inflamatório por conduzir a passagem dos leucócitos entre os compartimentos teciduais. Já está documentado na literatura que vários tipos de células endoteliais expressam receptores A2A e A2B (HASKÓ e CROSTEIN, 2004) e que estas células também são uma fonte importante de adenosina extracelular por sua capacidade de desfosforilar os nucleotídeos de adenina (AMP) em adenosina, os quais são liberados dos neutrófilos durante a transmigração através do endotélio (LENNON et al., 1998).
A expressão dos receptores de adenosina A1, A2A, A2B e A3 sobre os linfócitos T no homem e em camundongo já tem sido descrita (LAPPAS et al., 2005). O reconhecimento do antígeno pelo complexo TCR inicia uma cascata de eventos que tem como resultado final a ativação das células T, demonstrado pela síntese e secreção de citocinas como o IFN-γ e IL-2, pela citotoxicidade celular e proliferação de células T. LAPPAS et al. (2005) investigaram o efeito da ativação das células T CD4+ mediado pelo complexo TCR sobre a expressão dos receptores de adenosina e o papel desses receptores na regulação da atividade dos linfócitos efetores. Assim, esses autores mostraram que a ativação das células T CD4+ pelo complexo TCR leva a uma rápida up-regulation da expressão dos receptores A2A de adenosina e que a adenosina exógena através desses receptores pode agir como um regulador endógeno da resposta inflamatória mediada pelos linfócitos T CD4+, formando dessa maneira um
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feedback no qual a adenosina liberada do tecido inflamado serve para inibir a
atividade dos linfócitos T CD4+ e também, por fim, a atividade dos macrófagos (LAPPAS et al., 2005).
Um grande avanço no conhecimento da imunologia das células apresentadoras de antígeno (APCs) foi a descoberta dos receptores de reconhecimento padrão, que permite o reconhecimento de elementos microbianos repetidos conservados tais como o lipopolissacarídeo (LPS) e o RNA viral, e nesse padrão se inclui os receptores Toll-like (TLRs). A ativação dos receptores de adenosina sobre os monócitos e macrófagos suprime fortemente a produção de IL-12, uma citocina pró-inflamatória, induzida pelo LPS através do TLR4. Em outras observações, a estimulação dos receptores de adenosina diminui a liberação induzida pelo TLR4 de outros mediadores pró- inflamatórios do hospedeiro incluindo o TNF-α, MIP1 e óxido nítrico (NO), enquanto que aumenta a produção da citocina anti-inflamatória IL-10. (HASCO
et al., 1996; SZABÓ et al., 1998). Em recente estudo utilizando camundongos knockout para os receptores A2A e A3 demonstrou-se que ambos receptores
contribuem para a supressão da produção de mediadores pró-inflamatórios seguidos da estimulação de TLR (PINHAL-ENFIELD et al.; 2003; NÉMETH et
al., 2003; MAJUMDAR e AGGARWAL, 2003).
Portanto, o aumento da concentração de adenosina em pacientes com sepse ou mesmo com outras patologias pode, não somente, refletir a severidade da hipóxia tecidual, mas também ser de uma significância biológica para a regulação das células pertencentes ao sistema imune (inato e adaptativo), especialmente as células imunes que expressam receptores de adenosina (THIEL et al., 2003).
Existem muitas abordagens terapêuticas promissoras que estão centradas na modulação do sistema da adenosina no sistema imune. Esses compostos farmacológicos visam interferir na quebra ou na geração da molécula, bem como atuarem como agonistas ou antagonistas dos receptores de adenosina.
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Foi relatado que a adenosina é importante em várias condições patológicas. Na asma e na doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), a adenosina, quando inalada, pode induzir uma bronquioconstrição em pacientes asmáticos ou com DPOC mas não em indivíduos saudáveis, e o bloqueio do receptor de adenosina previne esse tipo de resposta. Também foi visto que tanto os níveis de adenosina quanto a expressão de seus receptores estão elevados nas células imunes em pacientes com ambas as patologias pulmonares. Acredita-se que esses efeitos inflamatórios sejam mediados pela estimulação dos receptores A2B e A3 em mastócitos ativados. Estudos de fase I para tratamento das doenças com antagonista de A2B estão sendo desenvolvidos e aparentam ser bem promissores (HASKO et al., 2008). Já na inflamação pulmonar, em que resulta no acúmulo de neutrófilos e outros leucócitos nos espaços intersticiais e nas vias aéreas, o uso de agonistas do receptor A2A tem mostrado reverter a migração e o infiltrado inflamatório nesse órgão.
Da mesma forma, estudos mostraram que a ativação do receptor A2A apresenta um efeito protetor durante o processo inflamatório gerado na lesão por isquemia-reperfusão em diversos órgãos, como fígado, rins, coração e pele, prevenindo o infiltrado inflamatório, a produção de radicais livres e secreção citocinas do perfil pró-inflamatórias (HASKO et al., 2008).
Evidências sugerem que o efeito anti-inflamatório do metotrexato e sulfasalazina, um dos tratamentos mais eficazes e considerados agentes de segunda linha para o tratamento da artrite reumatóide, é mediado em parte pelo aumento das concentrações extracelulares de adenosina (CRONSTEIN et al., 1993). Inicialmente desenvolvido como uma drogra antineoplásica, o mecanismo anti-inflamatório do metotrexato, em baixas doses, envolve a inibição da proliferação celular e indução da liberação de adenosina. Acredita-se que parte dos efeitos benéficos mediados pelo metotrexato seja via o receptor A3, uma vez que o agonista desse receptor IB-MECA induz uma melhora da artrite reumatóide. Testes clínicos de fase II com tal agonista estão em andamento (HASKO et al., 2008).
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Em estudos envolvendo o processo de reparo de lesões na pele, foi demonstrado que a ativação dos receptores A2A e A2B aceleram a cicatrização de feridas, estimulando a proliferação de células endoteliais e promovendo a angiogênese. Esses dados mostram que a adenosina possui um papel importante no processo de cicatrização. Algumas pesquisas, inclusive, têm realizado testes com agonista de A2A via tópica para o tratamento das úlceras epiteliais em pacientes diabéticos (HASKO et al., 2008).
As doenças inflamatórias intestinais (do inglês IBD - Inflammatory Bowel
Disease), como doença de Crohn's e colite ulcerativa, são caracterizadas por
uma disfunção das células T, em especial linfócitos T CD4+CD25+ reguladores (Treg), alteração da produção de citocinas e infiltrado inflamatório, que leva a lesão da mucosa intestinal. Vários estudos em modelos de colite em animais evidenciam o papel protetor do receptor A2A. Quando ativado por um agonista, este levaria a uma diminuição das células inflamatórias e elevaria a atividade dos linfócitos Treg, células consideradas mestres reguladores da resposta inflamatória na mucosa intestinal (HASKO et al., 2008).
Alguns trabalhos apontam a participação dos receptores A2B como potencial alvo para o tratamento de IBD. Foi demonstrado que esse subtipo é responsável por mediar as respostas pro-inflamatórias da adenosina no intestino e que o tratamento com um antagonista (ATL-801) interfere positivamente com a progressão da colite experimental induzida por DSS (do inglês - dextran sodium
sulfate) (ANTONIOLI et al., 2008).
Outras pesquisas confirmam o potencial anti-inflamatório da adenosina, mediada pela ativação dos receptores A2A. Um agonista seletivo do receptor A2A
da adenosina (ATL 146e), inibiu significativamente a inflamação na mucosa gástrica induzida por aspirina, em um modelo experimental em ratos (ODASHIMA et al., 2006). Outro agonista do receptor A2A, CGS 21680 (2-p-(2- carboxyethyl) phenethylamino- 5_-N-ethylcarboxamidoadenosine), exerce efeitos inibitórios na contração colinérgica elétrica, agindo com eficácia no cólon de ratos submetidos à colite experimental (ANTONIOLI et al., 2006). Ainda um
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estudo in vitro demonstrou que o CGS 21680 acelera o sequestro de cálcio citosólico em neutrófilos ativados por fMLP, levando a inibição da função neutrofílica, cálcio dependente (ANDERSON et al., 2000).
Com o intuito de avaliar o potencial efeito anti-inflamatório da adenosina no trato gastrointestinal, nos últimos anos, nosso grupo de pesquisa vem se dedicando estudar o papel da adenosina e de seus receptores em modelos animais tratados com as toxinas A e B do Clostridium difficile. Um artigo publicado por nosso grupo de pesquisa demonstrou que o agonista do receptor A2A (ATL 313) reduziu a enterite induzida pela TcdA do Clostridium difficile em
camundongos. Neste trabalho, demonstramos de forma inédita, que a TcdA induzia aumento do processo inflamatório e de atividade de adenosina desaminase (ADA) no tecido da alça ileal. Entretanto, o tratamento com ATL 313 reduziu a secreção de fluidos e o edema, o infiltrado neutrofílico, a morte celular