suas cadeias variáveis
Anticorpos possuem uma vasta aplicação, principalmente na área médica, podem ser utilizados em tratamentos e diagnósticos de diversas doenças e também como marcadores celulares, moduladores da rejeição em pacientes transplantados, na desintoxicação por drogas, na composição de conjuntos de reativos (kits) para diagnóstico como, por exemplo, sarampo, dengue 1, 2, 3 e 4, hepatite A, B e C, Ieptospirose, febre amarela e na terapia de uma grande variedade de doenças auto-imunes, como artrite, lúpus eritematoso, anemia e asma (HON 2008) e ainda em diversas formas de imunoterapia, como no caso do tratamento de câncer (JÄGER & KNUTH 2005) e de ofidismos.
Os anticorpos monoclonais humanos são os mais indicados na utilização como agentes terapêuticos, entretanto, as fontes de anticorpos humanos restringem-se a indivíduos infectados ou vacinados com o antígeno, assim, raros são os anticorpos terapêuticos efetivos obtidos destas fontes (ADRIS-WIDHOPF et al. 2000). Como alternativa, geralmente são obtidos anticorpos específicos por imunizações de animais com o antígeno desejado, seguidas por seleção de clones obtidos em técnicas de hibridomas. Porém, a utilização destes anticorpos em imunoterapias não é recomendada, pois representam proteínas heterólogas ao organismo humano; assim, para eliminar os efeitos negativos observados em imunoterapias, estes anticorpos geralmente passam por um processo de humanização (KOHLER & MILSTEIN 1975; MARANHÃO 2000).
A utilização de galinhas para a produção de anticorpos terapêuticos é uma opção considerável, pois numerosos alvos com grande potencial clínico que
despertam tolerância imunológica em mamíferos são imunogênicos em espécies não mamíferas, como as aves (SONG et al. 1985).
As aves possuem uma série de particularidades em seu sistema imunológico, as quais as diferenciam de mamíferos, sob o ponto de vista anatômico e funcional. Estas características próprias incluem estruturas especializadas, ligadas à formação e amadurecimento do sistema imunológico e suas células - como o Timo e a Bursa de Fabricius - e estruturas menos complexas, porém responsáveis por níveis mais primários de defesa, como as penas e pele. BUTCHER & MILES (2003) classificam estes órgãos e estruturas como componentes de resposta imunológica específica ou inespecífica, de acordo com seu modo de atuação. As denominações natural e adquirida ou inata e adaptativa também são utilizadas (MORGULIS 2002). Os órgãos do sistema imunológico das aves podem ser classificados em: primários – encarregados da formação e diferenciação das células deste sistema (timo e bursa de Fabricius); e secundários - órgãos para os quais estas células migram ou onde se agrupam, formando sítios de amadurecimento/diferenciação e atuação: glândula de Harder, baço, tonsilas cecais, placas de Peyer.
A Bursa de Fabricius (BF) é, provavelmente, a diferença anatômica/estrutural mais marcante do sistema imunológico das aves. Esta estrutura desempenha papel fundamental no processo de amadurecimento e diferenciação dos linfócitos B (papel desempenhado pela medula óssea em mamíferos e camundongos).
Os linfócitos das aves são classificados em células T e B (linfócitos “pequenos”) e células NK (Natural Killer). Estas células são morfologicamente muito semelhantes às dos mamíferos (MORGULIS 2002). Agentes como o vírus de Gumboro ou determinadas substâncias químicas podem causar a depleção das células precursoras dos linfócitos B, comprometendo a resposta imunológica humoral em galinhas (SHEELA et al. 2003). A BF é também sítio de ocorrência do fenômeno de conversão gênica, um processo de recombinação homóloga que confere aos linfócitos B uma maior capacidade de diversificação na decodificação de moléculas de anticorpos (MORGULIS 2002). O desenvolvimento das células B em galinhas pode ser dividido em três estágios: pré-bursal, bursal e pós-bursal. Inicialmente, células embrionárias produzidas no fígado, no saco vitelínico e na
medula óssea, migram para a BF, local onde sofrem diferenciação até o vigésimo dia e, ao fim deste período, 90% das células aprestam-se como linfócitos B diferenciados. Depois de quatro semanas da eclosão do ovo, a bursa involui e perde a capacidade de gerar células B (WELL & REYNAUD 1987, citado por MARANHÃO 2001; BUTCHER & MILES, 2003).
Os loci de imunoglobulinas de galinhas ocorrem como exposto a seguir, e podem ser visto na figura 3. A região variável da cadeia leve (VL) dos anticorpos é formada pelos segmentos gênicos VL1 e JL distribuídos no locus cIgL. Já a
região variável da cadeia pesada (VH) é codificada pelos segmentos VH1, D e JH,
que se distribuem no locus cIgH. Tanto para cadeia leve quanto para cadeia pesada de IgY, é observado apenas um segmento V funcional (VL1 e VH1,
respectivamente). Grupos de pseudogenes ψV (ψVH para o locus cIgH e ψVL para
o locus cIgL) são encontrados anteriormente aos segmentos V funcionais. Há 25 segmentos ψVL, os quais ocupam cerca de 20kb no genoma da galinha. Após
1,8kb do segmento VL1, encontra-se o único segmento JL e, na sequência, o
domínio constante lambda (Cλ) pode ser encontrado após 1,6 kb do JL
(MARANHÃO 2001).
A organização do locus cIgL é semelhante ao cIgH, porém, neste podem ser encontrados 80 pseudogenes ψVH localizados a 80kb antes do segmento
funcional VH1. Um número de 16 segmentos D ocorre na região 3’, após o
domínio funcional VH1 e são distribuídos em aproximadamente 15kb. O único
segmento JH do locus da cadeia pesada localiza-se em seguida aos segmentos D
e em seqüência encontra-se o segmento constante µ, com uma distância aproximada de 22kb do segmento JH (MARANHÃO 2001). Os segmentos ψV são
considerados pseudogenes por não codificarem proteínas funcionais, representam seqüências homólogas a segmentos V com menos de 100 pb.
A montagem do gene codificador dá-se pelo processo de recombinação gênica, que consiste em rearranjos envolvendo o único segmento V funcional de ambos loci.
Figura 3. Organização dos locus de imunoglobulina de galinhas. (A) locus da cadeia leve mostrando
cerca de 25 pseudogenes (quadrados pretos); VL (azul) - único segmento funcional; JL (amarelo)- um segmento de junção; CL(vermelho) - segmento da cadeia constante. (B) locus da cadeia pesada mostrando cerca de 80 pseudogenes (quadrados pretos); VH (azul) - único segmento funcional; D (verde) - exclusivos da cadeia pesada; JH (amarelo); CH (vermelho) - segmento da cadeia constante. (MARANHÃO 2001).
A recombinação ocorre num período curto (do 10° ao 15° dias de vida embrionária) e não é observada após a eclosão do ovo. Para gerar cadeia leve, VL1 é rearranjado com JL e para cadeia pesada, VH1 com D e JH. A diversidade
gerada pelo rearranjo é limitada devido ao fato de haver apenas um segmento gênico V e um J para cada uma das cadeias, sendo criadas neste processamento o máximo de 2x104 combinações diferentes (ARAKAWA et al. 1996).
Após a recombinação, inicia-se o processo de conversão gênica que reforça a capacidade das aves de produzirem uma grande multiplicidade de
(B) locus da cadeia pesada de galinha (A) locus da cadeia leve de galinha
anticorpos. Estudos feitos com a utilização de roedores revelaram que os mamíferos utilizam outras rotas para a obtenção desta variabilidade (MORGULIS 2002). A conversão gênica tem inicio após 18 dias de desenvolvimento embrionário e segue após eclosão do ovo, ocorrendo também nos órgãos linfóides secundários (baço e linfonodos). Este mecanismo se dá por substituição do material genético dos segmentos rearranjados por pseudogenes V (VL1, VH1).
Os genes de galinhas rearranjados e posteriormente convertidos sofrem ainda o processo de hipermutação somática (semelhante ao humano). Como resultado, são freqüentemente observadas mutações ao logo dos CDR e arcabolços (Frameworks).
Em síntese, a conversão gênica é o principal processo gerador de diversidade para as imunoglobulinas de aves, especialmente galinhas, enquanto nos mamíferos a variabilidade é determinada principalmente por rearranjo (MEHR et al. 2004).
As imunoglobulinas das aves são divididas em três diferentes tipos: IgA, IgM e IgG. A IgG das aves (igY) possui maior massa molecular que seu correspondente em mamíferos e possui algumas características próprias. Atualmente, muitos pesquisadores utilizam as IgGs presentes na gema do ovo embrionado para a produção de anticorpos policlonais, utilizados em pesquisa médica. O volume de IgG obtida de um único ovo é muito maior do que aquele possível de ser obtido do soro de coelhos ou outras cobaias em uma semana de colheitas (CHUI et al. 2004).
As imunoglobulinas surgem em média 4 a 5 dias após a exposição do sistema imunológico ao antígeno. Sua duração no organismo é variável, sendo mais fugaz para as IgM´s (cerca de 10 a 12 dias) e mais persistente para as IgG´s (de 20 a 25 dias). As IgAs são responsáveis pela imunidade “local”, estando presentes nas mucosas e secreções. As IgG´s são as imunoglobulinas mais importantes para o sistema imunológico e para a monitoria de seu “status”, já que a maioria dos testes laboratoriais busca quantificar esta classe de moléculas (BUTCHER & MILES 2003).