A qualidade e o número das CTHs podem ser avaliados in vitro por meio de ensaios de progenitores hematopoéticos como as culturas em meio semi-sólido com estímulo de citocinas e fatores de crescimento, ou culturas de medula óssea de longa permanência. Além disso, estes ensaios fornecem uma avaliação funcional do estroma medular, sua capacidade proliferativa e de manutenção da hematopoese (López-Holgado et al.,2005; Lanza et al., 2001; Selleri et al., 1999).
A extensão dos danos causados à medula óssea pela quimioterapia e radioterapia está relacionada à diminuição da quantidade de progenitores hematopoéticos comprometidos. Consequências desta redução podem ser observadas em análises histopatológicas de medula óssea através da presença de diferentes graus de hipocelularidade global e da série branca. As células estromais, no entanto, são menos sensíveis à ação da terapia citotóxica e da radiação. Esta aparente resistência deve estar associada à baixa taxa de renovação da medula óssea intacta, porém, após altas doses de quimio ou radioterapia os componentes estromais podem apresentar sérios danos funcionais e estruturais (van Hennik et al., 2000; Selleri et al., 1999; Del Cañizo et
al 1999; Galotto et al 1999; Domenech et al.,1994).
Diversos estudos funcionais realizados com portadores de doenças onco- hematológicas submetidos a transplante de medula óssea autólogo, demonstraram que altas doses de quimioterapia causam danos não só nas CTHs, mas também no microambiente medular. Entretanto, não se pode excluir que estes danos funcionais possam ter sido causados pelo regime quimioterápico de indução/consolidação ou pela agressividade hematológica da doença de base. Estudos empregando culturas de longa permanência evidenciaram este ensaio como fator prognóstico de recuperação hematológica de curto e longo prazo, correlacionando a formação deficiente da camada estromal com uma pobre reconstituição hematológica após transplante de medula óssea autólogo (Cashen
et al. 2007; van Hennik et al., 2000; Domenech et al., 1994; Gilabert & Ayats,
Em nossa análise foi observada uma diminuição da capacidade de formação do estroma após a mobilização nas amostras dos controles. Este resultado pode estar associado ao fato que após a mobilização a quantidade de células progenitoras imaturas está diminuída na medula óssea, sugerindo que quanto maior a migração destas células para o sangue periférico, menor será a quantidade de células progenitoras na medula óssea e como consequência ocorrerá formação de um estroma mais deficiente. Uma vez que é sabido que a recuperação hematológica é mais rápida quando se utiliza células progenitoras mobilizadas quando comparada com células obtidas diretamente da MO, pressupõe-se que seja porque o produto da leucoaférese deva conter uma quantidade maior de progenitores que a MO após a mobilização (Cashen et
al.,2007; Theilgaard-Mönch et al., 1999). Esta hipótese pode ser corroborada pelo
estudo de López-Holgado et al. (2005) realizado com 72 doadores de MO para transplante alogênico utilizando culturas de longa permanência e ensaios clonogênicos. Eles observaram que as células do produto da leucoaférese apresentaram uma recuperação hematológica mais rápida quando comparadas com as culturas com células obtidas diretamente da medula óssea. Nesse mesmo estudo, as características individuais foram correlacionadas com rendimento da mobilização e capacidade proliferativa das células CD34+. A variação mais
importante foi relacionada ao sexo dos pacientes e doadores: indivíduos do sexo masculino apresentaram produção maior de todos os tipos de progenitores hematopoéticos e melhor confluência na cultura de longa permanência. Todavia, a variação da idade não apresentou diferença estatística significativa naqueles doadores analisados. Em nossa análise, as características individuais dos pacientes e doadores como idade e sexo não apresentaram diferenças significativas na capacidade de estabelecimento do estroma, o que também foi observado por Domenech et al.(1994) em seu estudo com pacientes portadores de doenças hematológicas e tumores sólidos submetidos a TMOA.
Em nosso estudo as amostras de pacientes apresentaram aparente diminuição da capacidade de formação da camada estromal quando comparados com os controles na fase pré-mobilização. Estes resultados são confirmados em parte pelo estudo de Lanza et al. (2001) que analisaram por meio de culturas de longa permanência, ensaios de CFU-F (unidades formadoras de colônia de
fibroblastos) e ensaios clonogênicos, amostras de MO de 34 pacientes portadores de doenças hematológicas submetidos à TMOA. Eles demonstraram que houve uma redução na quantidade de CFU-F e também na capacidade de formação da camada estromal em relação aos controles normais. Neste estudo o tempo decorrido entre mobilização e coleta de MO foi de quatro semanas, com intuito de minimizar o efeito imediato citotóxico no microambiente medular causado pela quimioterapia de mobilização. No entanto, em nosso estudo este efeito citotóxico imediato não foi observado, pois as coletas de MO para análise da fase pós- mobilização foram realizadas no dia da leucoaférese (após a quimioterapia de mobilização e administração do fator de crescimento) e o comportamento das culturas de longa permanência indicou formação da camada estromal semelhante à fase pré-mobilização para o grupo dos pacientes, porém reduzida para o grupo dos controles.
Dessa forma, como os controles foram submetidos somente à ação do G- CSF, sugerimos outra hipótese relacionando o efeito negativo imediato do fator de crescimento ao microambiente medular normal. A medula óssea intacta seria mais suscetível à ação do G-CSF? Este possível dano funcional permaneceria no microambiente medular de doadores normais, ou a medula óssea seria completamente recuperada? Para elucidar estas questões seriam necessários outros ensaios funcionais utilizando amostras de MO de doadores submetidos à terapêutica de mobilização, após um período mais longo para recuperação hematológica completa da medula óssea.
Estudos relacionados com o efeito do G-CSF pouco discorrem a respeito da questão funcional relacionada ao microambiente hematopoético. Cashen et al. (2007) em uma revisão sobre os efeitos fisiológicos e tóxicos do G-CSF e outros fatores de crescimento empregados na mobilização das CTHs, descrevem como toxicidade comum: febre, cefaléia, reação local e dor óssea; e como efeitos tóxicos incomuns ruptura esplênica, trombose, surgimento de doenças auto- imunes e precipitação de crises de falcização. Eles também sugerem a necessidade de outros estudos que elucidem as interações entre as CTHs, o microambiente medular e os efeitos dos fatores de crescimento empregados na terapêutica de mobilização.
Em relação às doenças analisadas separadamente observou-se em nosso estudo um comportamento semelhante de formação da camada estromal nas fases pré e pós-mobilização diferindo apenas nas amostras de MO de pacientes portadores de LNH. Recentes estudos empregando culturas de longa permanência e ensaios clonogênicos demonstraram que as CTHs de pacientes com LNH difuso de grandes células B (LNH-DGCB) pós-quimioterapia, apresentam uma proliferação deficiente quando comparadas à medula normal e que a capacidade de formação do estroma está reduzida nas amostras de pacientes em relação aos controles (Martínez-Jaramillo et al.,2004; Huerta- Zepeda et al.,2000). No nosso estudo este fato foi observado através do insucesso na LTBMC, as amostras analisadas formaram uma camada estromal deficiente na fase pré e nenhuma das amostras dos pacientes com LNH obteve sucesso na formação do estroma na fase pós-mobilização, possivelmente devido ao caráter agressivo das doenças analisadas.
As nossas amostras de controles apresentaram a maior velocidade de formação do estroma antes da mobilização, ou seja, amostras de MO sem nenhum tipo de doença hematológica e que não tiveram nenhum tipo de manipulação. As leucemias apresentaram nas LTBMC características de crescimento semelhantes aos controles. As pesquisas anteriores utilizando cultura tipo Dexter com LMA são discrepantes. Ailles et al. (1997) estudaram o comportamento de culturas de pacientes com LMA, demonstrando a manutenção de células blásticas em longos períodos de cultura. Entretanto, Sparrow et al. (1997), não obtiveram o mesmo desempenho na sustentação de culturas, demonstrando uma aderência deficiente das células à placa de cultura, desprendendo-se da camada aderente após alguns dias de cultivo em 50% dos pacientes analisados. Interações anormais entre células hematopoéticas em desenvolvimento e seu microambiente podem, ao menos em parte, causar a saída prematura de blastos nas leucemias, mas ainda não está claro se um microambiente medular “leucêmico” existe (Greenberger,1992; Liesveld et
al.,1993; Liesveld et al.,1994; Reuss-Borst et al.,1995; Reuss-Borst et al.,1992;
Teixidó et al.,1992; Diamond & Springer,1994).
As amostras de pacientes portadores de mieloma múltiplo apresentaram um início de confluência mais rápido (segunda semana), porém esta era discreta
e não foi superior a 30%. Visani et al.(1989) demonstraram que as LTBMC de pacientes com mieloma múltiplo, eram capazes de sustentar a hematopoese por quatro semanas sem a proliferação de células neoplásicas. Tal achado sugere que este tipo de cultura fornece condições para crescimento seletivo de células hematopoéticas normais, suprimindo o desenvolvimento de células plasmáticas (Bloem et al., 1998). A quantidade de células mononucleares plaqueadas em cultura foi de 2x106/mL. Devido ao fato das MO de dois pacientes estarem infiltradas por plasmócitos, a quantidade real de células hematopoéticas normais com capacidade de proliferação e sustentação do estroma podem ter sido reduzidas, não sendo capazes desta forma de formarem uma confluência adequada. Outra questão que pode ter contribuído para o insucesso da cultura, é o tratamento prévio com radioterapia, uma vez que já é sabido que este procedimento causa danos no microambiente medular (Galotto et al., 1999). Observou-se ainda um aumento na quantidade de macrófagos nas culturas de MM (dados não mostrados) em relação aos controles normais, fato este que confirma estudos anteriores realizados por Faid et al. (1996), que observaram 48% de macrófagos presentes nas culturas de longa permanência de amostras de pacientes com MM contra 30% dos controles, podendo este fato estar relacionado com as interações das células neoplásicas do mieloma com o microambiente medular.
Apesar de não terem sido encontradas diferenças significativas nos parâmetros como fibrose, infiltração e celularidade da MO, pode-se supor que essas características possam interferir na velocidade de estabelecimento do estroma. As amostras de pacientes que apresentaram crescimento mais lento possuíam fibrose e/ou hipoplasia de MO. A fibrose poderia causar uma dificuldade na aspiração da MO, associada com a diminuição da celularidade que resultariam em material com menor quantidade de células progenitoras mais imaturas, e uma consequente dificuldade de estabelecimento do estroma na LTBMC. Outros parâmetros analisados como tempo entre diagnóstico e mobilização, status da doença, grupos de doenças, tipos de amostra, dados das biópsias de MO e de mobilização também não apresentaram influência significativa na formação da camada estromal. Este fato pode ser devido ao número de pacientes estudados, pois os fatores como um tempo prolongado entre o diagnóstico e a mobilização e
a presença de doença na MO apresentam uma tendência a um crescimento mais lento do estroma.
Nos ensaios clonogênicos, a adição de fatores de crescimento à cultura promove a resposta celular imediata ou, ausência dela no caso de hematopoese deficiente. Corazza et al. (2004) demonstraram que pacientes com LLA apresentam uma diminuição de progenitores BFU-E e CFU-GM, quando comparados com controles normais. Estes pesquisadores também demonstraram que os níveis de TGFβ estão maiores em pacientes que em controles, isto está correlacionado inversamente com o número de BFU-E presentes nas culturas, o que sugere a capacidade inibitória do TGFβ secretado em grande quantidade pelas células estromais. A anemia associada às leucemias foi correlacionada com a diminuição no pool eritropoético (CFU-E), indicado por um baixo nível do receptor solúvel da transferrina, em contraste a um aumento da produção de EPO em resposta à anemia. Apesar de nossa pequena amostragem, nossos resultados confirmam esses achados, pois um paciente com LMA na cultura do estroma e co-cultura com células CD34+ de doador, não apresentou nenhuma colônia eritróide, mas apresentou colônias granulocíticas em quantidade relativamente semelhante ao controle.
Outro achado em nossos dados é que apenas os estromas obtidos de amostras de pacientes pós-mobilização e co-cultivados com células CD34+
apresentaram atividade proliferativa nos ensaios clonogênicos, com exceção do controle normal co-cultivado com célula CD34+ autóloga. É sabido que células
mais maduras já comprometidas também expressam este marcador. Pode-se dessa forma supor que após a mobilização, seja encontrada quantidade maior de células mais imaturas gerando mais colônias após o estímulo com fatores de crescimento na cultura semi-sólida.
Em virtude da diversidade de doenças analisadas e do número de pacientes com características heterogêneas no momento do TMOA, do tratamento quimioterápico prévio, grau de comprometimento medular e status da doença, não foi possível traçar um parâmetro linear entre todos os pacientes estudados. Porém, foi observado que a celularidade e a fibrose medular, associadas à doença não-controlada, estão diretamente relacionados ao insucesso na capacidade de formação do estroma sugerindo fortemente que os
danos maiores estão relacionados ao estroma medular possivelmente causados pelo tratamento quimioterápico prévio. A correlação entre a formação da camada estromal e o status de mobilização não foi estabelecida nesta análise, pois não foi notada diferença significativa entre os maus e bons mobilizadores, apenas uma tendência dos bons mobilizadores de formarem menos a camada estromal na LTBMC.