Avaliamos a produção de ERO nas células de linhagem SK Hep-1 através do marcador carboxy-H2DCFDA por citometria de fluxo. As células foram incubadas com os extratos hidroetanólico ou aquoso de B. trimera, quercetina ou rutina em dois tempos distintos (30 minutos – painel A e 6 horas – painel B). Os resultados da Figura 21 – Painéis A e B demonstram que não há diferença na produção de ERO em células incubadas com 10 µg mL-1 dos extratos hidroetanólico (He) ou aquoso (Aq) de B.
trimera. O mesmo perfil foi observado para a quercetina (Que) e rutina (Rut) na concentração de 10µM. Para avaliar o efeito dos extratos de B. trimera na modulação da produção de ERO através da via da PKC, as células foram pré-incubadas com os extratos hidroetanólico ou aquoso de B. trimera (10 µg mL-1), quercetina ou rutina (controles positivos; 10µM), seguidos de uma incubação com PMA+ionomicina. Observamos também que nestas concentrações, os extratos de B. trimera, quercetina e rutina não foram capazes de alterar a produção de ERO em nenhum dos tempos avaliados.
Figura 21: Produção de ERO em células SK Hep-1 expostas aos extratos hidroetanólico e aquoso (10 µg mL-1) de B. trimera e aos compostos quercetina e rutina (10 µM). Painel A: As células foram expostas aos tratamentos com 10 µg mL-1 dos extratos hidroetanólico (He) ou aquoso (Aq) de Baccharis trimera, 10 µM de quercetina ou rutina, ou 20 µM de DPI por 30 minutos, e os grupos estimulados foram posteriormente incubados com PMA+Iono. Painel B: As células foram tratadas com as mesmas concentrações dos extratos de B. trimera ou os compostos quercetina, rutina ou DPI por 6 horas, e os grupos estimulados tratados posteriormente por 30 minutos com PMA+iono. Os resultados são expressos como média±erro padrão. Para a análise estatística foi realizado o teste ANOVA one-way, seguido do pós-teste de
A Figura 22 mostra os resultados obtidos com as células expostas às concentrações de 25 µg mL-1 dos extratos hidroetanólico (He) ou aquoso (Aq) de B.
trimera e 25µM dos compostos quercetina e rutina durante 30 minutos (painel A) ou 6 horas (painel B), seguidas ou não pela incubação com os ativadores da PKC. Podemos observar que na concentração de 25 µg mL-1, os extratos hidroetanólico e aquoso foram capazes de modular a produção de ERO em células não estimuladas (basal) no tempo de exposição de 30 minutos (Painel A). Assim como os extratos de B. trimera, a quercetina na concentração de 25µM também foi capaz de reduzir significativamente a produção de ERO nas células SK Hep-1, entretanto não foi observado nenhum efeito da rutina. Observamos ainda que nas células previamente expostas aos extratos de B. trimera, quercetina e rutina, durante 30 minutos e posteriormente estimuladas (PMA+iono), não observamos nenhuma diferença em relação à produção de ERO quando comparadas às células estimuladas (PMA+iono) (Painel A). No Painel B observamos que apenas o extrato hidroetanólico de B. trimera foi capaz de diminuir a produção de ERO quando comparado com as células controles (não estimuladas). Já nas células expostas com os extratos hidroetanólico e aquoso, quercetina ou rutina por 6 horas, observamos uma redução significativa na produção de ERO apenas em células pré-incubadas com 25µM de quercetina e posteriormente estimuladas com PMA+iono.
Figura 22: Produção de ERO em células SK Hep-1 expostas aos extratos hidroetanólico e aquoso (25 µg mL-1) de B. trimera e aos compostos quercetina e rutina (25 µM). Painel A: As
células foram expostas aos tratamentos com 25 µg mL-1 dos extratos hidroetanólico (He) ou
aquoso (Aq) de Baccharis trimera, 25 µM de quercetina ou rutina, ou 20 µM de DPI por 30 minutos, e os grupos estimulados foram posteriormente incubados com PMA+Iono. Painel B: As células foram tratadas com as mesmas concentrações dos extratos de B. trimera ou os compostos quercetina, rutina ou DPI por 6 horas, e os grupos estimulados tratados posteriormente por 30 minutos com PMA+iono. Carboxy - H2DCFDA foi utilizada para marcar
a produção de ERO, e para a análise foi utilizado citômetro de fluxo FACSCalibur. Os resultados são expressos como média±erro padrão. Para a análise estatística foi realizado o teste ANOVA one-way, seguido do pós-teste de Dunns. Este experimento foi realizado em duplicata em três experimentos independentes. *p<0.05, **p<0.001, ***p<0.0001 para valores significativamente diferentes do grupo controle (células controle, sem estímulo). ##p<0.001, ###p<0.0001 para valores significativamente diferentes do grupo controle estimulado
(C/PMA+iono).
Na Figura 23 – Painéis A e B podemos observar o efeito da incubação das células SK Hep-1 com os extratos hidroetanólico ou aquoso de B. trimera na concentração de 50 µg mL-1 e com os compostos quercetina ou rutina na concentração de 50 µM. Em 30 minutos de incubação (painel A) podemos observar que os extratos hidroetanólico e aquoso de B. trimera, quercetina e rutina foram capazes de diminuir significativamente a produção de ERO em relação às células não estimuladas (basal). No painel A também podemos observar que a pré-incubação das células com os extratos de B. trimera, quercetina ou rutina durante 30 minutos e posteriormente estimuladas com PMA+iono não foi capaz de alterar a produção de ERO. No Painel B, observamos que os extratos hidroetanólico e aquoso, assim como a quercetina foram capazes de
células pré-tratadas com extrato hidroetanólico e quercetina e posteriormente estimuladas com PMA+Iono.
Figura 23: Produção de ERO em células SK Hep-1 expostas aos extratos hidroetanólico e aquoso (50 µg mL-1) de B. trimera e aos compostos quercetina e rutina (50 µM). Painel A: As
células foram expostas aos tratamentos com 50 µg mL-1 dos extratos hidroetanólico (He) ou
aquoso (Aq) de Baccharis trimera, 50 µM de quercetina ou rutina, ou 20 µM de DPI por 30 minutos, e os grupos estimulados foram posteriormente incubados com PMA+Iono por mais 30 minutos. Painel B: As células foram tratadas com as mesmas concentrações dos extratos de B.
trimera ou os compostos quercetina, rutina ou DPI por 6 horas, e os grupos estimulados tratados posteriormente por 30 minutos com PMA+iono. Carboxy - H2DCFDA foi utilizada para marcar
a produção de ERO, e para a análise foi utilizado citômetro de fluxo FACSCalibur. Os resultados são expressos como média±erro padrão. Para a análise estatística foi realizado o teste ANOVA one-way, seguido do pós-teste de Dunns. Este experimento foi realizado em duplicata em três experimentos independentes. *p<0.05, **p<0.001, ***p<0.0001 para valores significativamente diferentes do grupo controle (células controle, sem estímulo). ##p<0.001, ###p<0.0001 para valores significativamente diferentes do grupo controle estimulado
(C/PMA+iono).
Ao final de todos os experimentos realizados avaliamos porcentagem de células viáveis pelo método de exclusão com azul de trypan (resultado não mostrado). A viabilidade das células em todos os experimentos foi maior que 85%. A figura 24 é a representação das imagens obtidas por citometria de fluxo, coluna 1 representa o tamanho por granulosidade da célula, coluna 2- representa o canal que identifica a fluorescência, coluna 3- representa o histograma que quantifica a quatidade de ERO formada e marcada nas células.
Figura 24: Gráficos representativos da análise de ERO por citometria de fluxo. 1-representa o tamanho da célula por sua granulosidade. 2-representa o canal que identifica a fluorescência no citômetro por granulosidade. 3- representa o histograma da quantidade de ERO observada. Painel A: células SK Hep-1 sem o marcador Carboxy - H2DCFDA. Painel B: Células SK Hep-
1 com o marcador Carboxy - H2DCFDA. Painel C: células estimuladas com PMA/iono e
5.5.3. Representação qualitativa da produção de ERO por microscopia de