As onças-pintadas foram capturadas de acordo com as atividades dos projetos de pesquisas do Instituto Onça-Pintada (IOP).
Os cães foram amostrados sempre que presentes nas propriedades, e os gatos domésticos, sempre que possível sua contenção física.
O planejamento amostral para as propriedades com bovinos visou simplesmente detectar a presença das enfermidades. Para o cálculo do tamanho da amostra, a população foi considerada como sendo infinita, o nível de confiança adotado foi de 95% e a prevalência intrarrebanho foi considerada como sendo de 5%. Através da tabela de Cannon e Roe (1982), obteve-se que 59 bovinos em cada propriedade seriam necessários para os objetivos desse estudo. As visitas às propriedades rurais foram, em sua maioria, agendadas para o período de vacinação do gado, de forma a maximizar os esforços do manejo pela propriedade. Algumas propriedades, porém, se prontificaram a manejar o gado apenas para as coletas propostas neste estudo. Assim, dado o caráter voluntário dessa atividade e as dificuldades logísticas das regiões estudadas, nem sempre foi possível obedecer ao planejamento amostral para os bovinos.
4.4 ANÁLISESLABORATORIAIS
O material biológico coletado em campo foi transportado, em média por 12 horas, em isopor com gelo reciclável, até a cidade de São Paulo-SP, e armazenado em freezer a -20°C, para posterior envio aos laboratórios parceiros para a realização dos testes diagnósticos propostos. O quadro 1 resume os testes realizados, laboratórios responsáveis e patógenos pesquisados em cada espécie.
A identificação de ectoparasitas foi realizada no Laboratório de Doenças Parasitárias no Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo. Os testes de tuberculinização foram realizados nas propriedades rurais.
Material
Biológico Patógenos Pesquisados
Teste Diagnóstico
Laboratório
Responsável Espécies Amostradas Brucela lisas AAT1 LZB2/VPS3/FMVZ4/USP5 Onça6, Bovino, Cão, Gato Leptospira spp. SAM7
LZB/VPS/FMVZ/USP Onça, Bovino, Cão, Gato Toxoplasma gondii MAT8/RIFI9 LDP10/VPS/FMVZ/USP Onça, Bovino, Cão, Gato Vírus da raiva RFFIT11 Instituto Pasteur Onça, Cão, Gato Vírus da cinomose SN12
Biovet Onça, Cão
Vírus da imunodeficiência felina Snap 13 LZB/VPS/FMVZ/USP Onça, Gato Soro
Vírus da leucemia felina Snap LZB/VPS/FMVZ/USP Onça, Gato Hepatozoon spp. PCR14 DP15/IB16/UNESP17 Onça, Cão, Gato Babesia spp. PCR DP/IB/UNESP Onça, Cão, Gato Cytauxzoon spp. PCR DP/IB/UNESP Onça, Cão, Gato Mycoplasma haemofelis Nested-PCR DP/IB/UNESP Onça, Cão, Gato C.Mycoplasma haemominutum Nested-PCR DP/IB/UNESP Onça, Cão, Gato Sangue
Total
C. Mycoplasma turicensis Nested-PCR DP/IB/UNESP Onça, Cão, Gato Mycobacterium spp. PCR LZB/VPS/FMVZ/USP Onça-pintada Cryptosporidium spp. Nested-PCR LDP/VPS/FMVZ/USP Onça-pintada Giardia intestinalis Nested-PCR LDP/VPS/FMVZ/USP Onça-pintada Fezes
Sarcocystidae Nested-PCR LDP/VPS/FMVZ/USP Onça-pintada
1
Teste do Antígeno Acidificado Tamponado. 2Laboratório de Zoonoses Bacterianas. 3Departamento de Medicina Veterinária e Saúde Animal. 4Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. 5Universidade de São Paulo. 6Onça-pintada. 7Microtécnica de Soroaglutinação Microscópica. 8Técnica de Aglutinação Modificada. 9Reação de Imunofluorescência Indireta.
10
Laboratório de Doenças Parasitárias. 11Teste de Inibição de Focos Fluorescentes. 12Soroneutralização. 13Snap Combo FeLV Antigen/FIV Antibody Test Kit (IDEXX Laboratories). 14Reação em Cadeia de Polimerase-Polymerase Chain Reaction.
15
Departamento de Parasitologia. 16Instituto de Biociências. 17Universidade Estadual Paulista, Botucatu-SP.
Quadro 1 – Patógenos pesquisados de acordo com o material biológico utilizado, teste diagnóstico realizado, laboratório responsável e espécies amostradas
Em algumas situações foi necessário priorizar as análises a serem realizadas de acordo com a quantidade de soro disponível para cada indivíduo. Para os bovinos, priorizou-se a realização dos testes sorológicos de brucelose, leptospirose e toxoplasmose nesta sequência; para os cães domésticos priorizou-se o sorodiagnóstico da cinomose, raiva, leptospirose, toxoplasmose e brucelose, nesta ordem; e, para os gatos domésticos priorizou-se o diagnóstico da imunodeficiência felina, leucemia felina, toxoplasmose, leptospirose e raiva.
As amostras de fezes foram primeiramente submetidas ao Laboratório de Biologia Genômica e Molecular – PUCRS e ao Departamento de Biologia da Conservação – Estación Biológica de Doñana para análise genética e confirmação de que, realmente, eram de onça- pintada. Quando comprovado geneticamente serem da espécie alvo, foram submetidas aos testes propostos neste estudo.
4.4.1 Testes sorológicos
São descritos a seguir os testes sorológicos utilizados no presente estudo para diagnóstico de determinados patógenos.
4.4.1.1 Diagnóstico de brucelas lisas
Para pesquisa de anticorpos contra brucelas lisas foi realizado o teste de rosa bengala com Antígeno Acidificado Tamponado (AAT) utilizando como antígeno Brucella abortus (cepa 1119-3), de acordo com as normas do Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose (BRASIL, 2006). O teste foi preparado com o antígeno na concentração de 8%, tamponado em pH ácido (3,65) e corado com o rosa de bengala. Com o soro e o antígeno à temperatura ambiente, colocou-se 30 µl de soro em uma placa de vidro e 30 µl do antígeno ao lado do soro. O soro e o antígeno foram misturados com movimentos circulares, obtendo-se um círculo aproximado de 2 cm. Após 4 minutos, a placa de vidro foi colocada na caixa de leitura com luz indireta, e a identificação da reação foi observada pela presença ou não de grumos. Foram utilizados controles positivo e negativo, previamente conhecidos.
4.4.1.2 Diagnóstico de Leptospira spp.
Para pesquisa de anticorpos contra Leptospira spp., os soros sanguíneos foram submetidos à Microtécnica de Soroaglutinação Microscópica (SAM) (FAINE, 1982) com uma coleção de antígenos vivos que inclui 22 variantes sorológicas de leptospiras patogênicas (Australis, Bratislava, Autummnalis, Butembo, Castellonis, Bataviae, Canicola, Whitcombi, Cynopteri, Grippotyphosa, Hebdomadis, Copenhageni, Icterohaemorrhagiae, Javanica, Panama, Pomona, Pyrogenes, Hardjo, Wolffi, Shermani, Tarassovi e Sentot) e duas de leptospiras saprófitas (Andamana e Patoc).
Os sorovares de Leptospira spp. foram repicados semanalmente, em meio liquido EMJH modificado, tendo como inóculo 10% do volume do meio. Foram utilizados apenas cultivos puros, isentos de contaminação, livres de autoaglutinação, com cinco a quinze dias de crescimento. As amostras de soros foram diluídas para triagem em solução tamponada de Sorënsen, inicialmente na diluição de 1:50, que, com acréscimo de igual volume de antígeno, o ponto de corte na diluição passou a ser de 1:100. Foi considerado reagente o soro que apresentou 50% de leptospiras aglutinadas. As amostras reagentes na triagem foram reexaminadas até sete diluições geométricas seriadas de razão de dois. O valor do título foi considerado a recíproca da sua maior diluição que apresentou 50% de aglutinação. A leitura das reações foi realizada em microscópio de campo escuro após a incubação da mistura soro- antígeno por três horas em temperatura de 28°C. Foram utilizados controles positivo e negativo, previamente conhecidos.
Para efeito do cálculo da frequência considerou-se soropositivo qualquer animal reagente para um ou mais sorovares. Para a determinação do sorovar mais provável (ou sorovar infectante), considerou-se o sorovar que apresentou maior título. Os indivíduos que apresentaram dois ou mais sorovares com títulos idênticos foram excluídos dessa análise Entretanto, esses animais foram considerados soropositivos para pelo menos um sorovar no cálculo da frequência (VASCONCELLOS et al., 1997; FIGUEIREDO et al., 2009). Os sorovares mais prováveis foram calculados por espécie e área de estudo.
4.4.1.3 Diagnóstico de Toxoplasma gondii
Para a detecção de anticorpos contra T. gondii em onças-pintadas foi utilizada a Técnica de Aglutinação Modificada (MAT) (DUBEY; DESMONTS, 1987). A MAT foi escolhida para a sorologia das onças, uma vez que não necessita de um conjugado antiespécie específico (DUBEY; THULLIEZ, 1989; DUBEY et al. 1995).
A diluição dos soros foi feita em microplacas (96 poços) em solução salina tamponada pH
7,2 (NaCl 0,146M; NaH2PO4 0,008M) filtrada em membrana de 45 µm de porosidade.
Primeiramente, foram feitas diluições de 1:25, 1:50 e 1:500. Em seguida, 120 µl de antígeno (taquizoítos inteiros fixados em formalina) foram diluídos em 2,5 ml de solução salina
50 µl de Azul de Evans 0,2%. Essa mistura foi homogeneizada e distribuída imediatamente em uma microplaca (96 poços) com fundo em “U”, resultando em 25 µl de reagentes por poço. Os soros diluídos foram transferidos para essa microplaca (25 µl) e misturados aos reagentes (v/v). A placa foi selada com plástico adesivo, para evitar evaporação, e incubada durante a noite, por 12 horas, em estufa a 37°C. A leitura foi realizada no dia seguinte, sendo que a formação de um botão de contorno definido na base do poço da placa foi considerada como resultado negativo; um carpete completo ou um véu de contorno pouco definido foi anotado como positivo (DUBEY; THULLIEZ, 1989). Os indivíduos com títulos maiores ou iguais a 25 foram considerados positivos. Os títulos dos soros foram determinados pela maior diluição que apresentou aglutinação (DUBEY et al., 1995). Em todas as reações foram utilizados controles positivo e negativo, previamente conhecidos.
Para a detecção de anticorpos contra T. gondii nos animais domésticos foi utilizada a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) (CAMARGO, 1964). Foram utilizadas lâminas contendo taquizoítos da cepa padrão (RH) do parasito e soros controles. Para os bovinos, utilizou-se como ponto de corte a diluição de 1:64 e, para cães e gatos domésticos, a diluição de 1:16. Os soros foram diluídos em solução salina tamponada de fosfatos (PBS 0,01 M pH 7,2). Em cada cavidade da lâmina pipetou-se aproximadamente 20 µl de cada soro. Após 30 minutos de incubação à temperatura de 37°C em câmara úmida, realizaram-se três lavagens de 10 minutos das lâminas em uma cuba de vidro contendo PBS. Após a secagem das lâminas, acrescentou-se,
em cada cavidade, o conjugado anti Ig-G específico para cada espécie (SIGMA®) previamente
diluído em solução de azul de Evans 0,01%. Após 30 minutos, em câmara úmida, a 37°C, realizaram-se as lavagens de 10 minutos em PBS. Após secagem, as lâminas foram montadas com glicerina tamponada com carbonato-bicarbonato 0,5 M pH 8,5 e lamínulas para leitura. A leitura das lâminas foi feita na objetiva 40X, em microscópio de epifluorescência com sistema de filtros para fluoresceína e lâmpada de mercúrio. Considerou-se positiva a reação onde a maioria dos campos observados apresentou taquizoítos com fluorescência verde em toda membrana celular, contra o fundo vermelho das formas coradas pelo Azul de Evans. A ausência de fluorescência ou a maioria dos campos com fluorescência apenas nas extremidades dos parasitas, conhecida como fluorescência apical, foram consideradas como reações negativas. As amostras positivas para o ponto de corte foram posteriormente diluídas para obtenção do título máximo da reação.
4.4.1.4 Diagnóstico do vírus da raiva
Para pesquisa de anticorpos contra raiva foi utilizado o Teste de Inibição de Focos Fluorescentes (RFFIT) (SMITH; YAGER; BAER, 1996).
Primeiramente os soros foram inativados em banho-maria a 56°C por 30 minutos. Realizou-se seis diluições seriadas de cada soro, na razão 2, começando de 1:5, colocando-se 25 µl de soro no primeiro orifício e adicionando-se 50 µl de Meio Essencial Mínimo de Eagle (MEM), com sais de Earle, suplementando com 10% de soro fetal bovino inativado. Após a diluição, adicionou-se 50 µl de vírus cepa CVS (Challenge Standard Virus) diluído previamente em banho
de gelo. As microplacas foram então incubadas a 37°C em estufa com 5% de CO2, por um
período de uma hora e meia. Adicionou-se 50 µl de suspensão de celular BHK-21 na
concentração 2,5 x 104 células/ml). E, novamente, as microplacas foram incubadas a 37°C em
estufa com 5% de CO2 por 20 horas. Após esse período, as células foram fixadas em banho de
gelo, utilizando acetona 80% gelada (SMITH; YAGER; BAER, 1996; CHAVES et al., 2006). A reação foi revelada com adição de conjugado antivírus da raiva produzido pelo Instituto Pasteur (CAPORALE et al. 2009). A leitura foi realizada em microscópio de fluorescência invertido LEICA DMIL com aumento de 200X.
Para os cães e gatos domésticos, que, normalmente são vacinados para o vírus da raiva, considerou-se como ponto de corte títulos ≥ 0,50 UI/ml, conforme recomendado pela Organização Mundial da Saúde (OMS, 1992). Para as onças-pintadas, que nunca tiveram contato com a vacina antirrábica, considerou-se como positivo o título ≥ 0,10 UI/ml (HILL; BERAN; CLARK, 1992; JORGE et al., 2010).
4.4.1.5 Diagnóstico do vírus da cinomose
Para pesquisa de anticorpos contra o vírus da cinomose foi utilizada a técnica de soroneutralização microscópica (APPEL; ROBSON, 1973). Primeiramente, os soros a serem testados foram inativados em banho-maria a 56°C. Realizaram-se diluições seriadas dos soros, que foram alocados em placas de microtitulação, adicionando-se volumes constantes de meio 209 (50 µl) e gentamicina (0,625 g/ml). Nas microplacas sem células e com o soro diluído foram
adicionados 50 µl da suspensão viral contendo 100 TCID50. Realizou-se a agitação cuidadosa das
placas para a homogeneização da mistura vírus-soro e as mesmas foram colocadas em estufa
úmida a -37°C, com 3 a 5% de CO2 por uma hora. Em seguida, acrescentou-se 100 µl de
suspensão de fibroblastos de embriões de galinha, contendo, aproximadamente, 50.000 células.
As microplacas foram incubadas em estufa úmida a 37°C, com 3 a 5% de CO2 por cinco dias. Cada
placa possuía controle de células, controle de vírus, e soro padrão. Após a incubação, as placas foram lidas em microscópio invertido para verificar a presença ou ausência de efeito citopático. O efeito citopático, quando presente, indica a ausência de anticorpos em títulos suficientes para neutralizar o antígeno. Os títulos foram determinados como o inverso da maior diluição que determinou proteção completa do tapete celular. Títulos ≥ 8 foram considerados positivos (COURTENAY; QUINNELL; CHALMERS, 2001).
4.4.1.6 Diagnóstico do vírus da imunodeficiência felina e leucemia felina
Para o diagnóstico da imunodeficiência felina (FIV) e leucemia felina (FeLV) foi utilizado o
teste de ELISA com os ensaios imunoenzimáticos comercias SnapTM Combo FeLV Antigen/FIV
Antibody Test Kit (IDEXX Laboratories), realizado de acordo com as orientações do fabricante. Esses kits combinam um teste direto para identificação do antígeno viral p27 do FeLV e um teste indireto para identificação de anticorpos específicos contra o vírus da imunodeficiência felina.
4.4.2 Testes moleculares nas amostras sanguíneas
Para extração do DNA para a pesquisa dos hemoparasitas, as amostras de sangue total foram submetidas à incubação com a enzima proteinase K, durante 4 horas, por 56° C e, posteriormente, durante 15 minutos, por 70°C (RUBINI et al., 2005). Durante todo o tempo da incubação, o sangue e a proteinase K foram mantidos sob agitação constante. A partir de
alíquotas sanguíneas de 200 µl, o DNA foi isolado empregando o kit GFX® Genomic Blood DNA
Purification (GE Healthcare), seguindo as recomendações do fabricante. Cada amostra de DNA foi eluída em 100 µl de tampão TE.
Posteriormente às reações, os produtos amplificados nos testes moleculares foram analisados em gel de agarose 1% corado com gel Red (0,05 µl/ml; Uniscience®) em alíquotas de 5 µl. As eletroforeses ocorreram a 80V, por 30 minutos, em tampão TAE, e os produtos foram visualizados através de um transiluminador UV. Os fragmentos de PCR amplificados foram estimados através da comparação com marcadores moleculares de DNA de 100 pares de base
(Invitrogen®). Foram considerados positivos os fragmentos que apresentaram banda de tamanho
específico e compatível com o produto amplificado por cada reação.
Os detalhes dos métodos de pesquisa para cada um dos hemoparasitas seguem abaixo:
4.4.2.1 Diagnóstico de Hepatozoon spp.
Realizou-se a reação em cadeia de polimerase (PCR) utilizando oligonucleotídeos iniciadores (ou “primers”) Hep F (5’-ATA-CAT-GAG-CAA-AAT-CTC-AAC-3’) e Hep R (5’-CTT-ATT- ATT-CCA-TGC-TGC-AG-3’) para amplificação de um fragmento da região do gene 18S rRNA (INOKUMA et al., 2002; METZGER et al., 2008). A reação de amplificação foi realizada em 25 µl
contendo: 10 mM de Tris-HCl em pH 8.3, 50 mM de KCl, 1 mM de MgCl2 (GE Healthcare), 0,2 µl
de dNTPs, 1,5 U de DNA taq polimerase (GE Healthcare), 1 µM de cada “primer” e 5 µl do DNA extraído. O controle negativo da reação não continha DNA e o controle positivo usado foi isolado de Hepatozoon sp. de uma jaguatirica (Genbank EU 028344) proveniente do Maranhão, diagnosticado por Metzger et al. (2008), e/ou um cão doméstico no Brasil, diagnosticado por Rubini et al. (2005).
Para as reações de PCR, utilizou-se termociclador Biometra thermal cycler (gradiente T) a 94°C por 3 minutos e 35 ciclos repetidos de 94°C por 1 minuto, 57°C por 2 minutos e 72°C por 2 minutos, seguidos por uma extensão final de 72°C por 7 minutos.
4.4.2.2 Diagnóstico dos Piroplasmas: Babesia spp. e Cytauxzoon spp.
Para a realização do PCR utilizou-se os oligonucleotídeos iniciadores Bab F (5’- TGACACAGGGAGGTAGT-3’) e Bab R (5’-CAACAAAATAGAACCAAAG-3’) para amplificação de
fragmentos da região do gene 18S rRNA de 293 a 318 pares de base (METZGER, 2009). Esse fragmento corresponde às sequências conservadas do DNA das espécies de piroplasmas descritas no quadro 2. Esses oligonucleotídeos iniciadores foram desenhados exclusivamente para amplificarem fragmentos de Babesia spp., Cytauxzoon spp. e Theileria sp.
Espécie Nº Genbak Espécie Nº Genbak
Babesia canis vogeli Brazil AY371196 Babesia canis canis Europa AY072926
Babesia Okinawa AY077719 Babesia felis AF965742
Babesia canis vogeli USA AY371198 Babesia leo AF244912
Babesia canis vogeli Egypt AY371197 Gato Brasil EF636702
Babesia canis canis Russia AY649326 Babesia felis AF244912
Babesia canis canis Europa AY072926 Babesia sp. AF244913
Babesia sp. AF244914 Babesia canis vogeli AY072925
Babesia rodhaini M87565.1 Babesia okinawa AY077719
Babesia gibsoni AF175300 Babesia canis canis AY072926
Babesia sp. AF396748 Babesia canis vogeli DQ439545
Babesia sp. okinawa AF271082 Theileria sp. DQ866842
Babesia sp. Israeli AY272047 Cytauxzoon felis AF399930
Babesia microti AB071177 Cytauxzoon felis L19080
Quadro 2 – Espécies de piroplasmas, com seus respectivos números de acesso no GenBank, que foram utilizadas para o alinhamento –uma das etapas para a construção de oligonucleotídeos iniciadores que amplificam fragmentos da região do gene 18S rRNA – respectivos às sequências conservadas de Babesia spp., Cytauxzoon spp. e Theileria sp
A reação de amplificação foi realizada em 25 µl contendo: 1 x Go Taq Colorless
Mastermix (Promega®), 10 pmol de cada oligonucleotídeo iniciador, 1 µl MgCl2 50 mM
(Invitrogen®), 5 µl do DNA extraído e água ultrapura (MiliQ®) q.s.p. Em todas as reações foi
utilizado um controle negativo através da substituição do DNA da amostra por água ultrapura
(MiliQ®). Os controles positivos consistiram de: um isolado de Babesia canis vogeli de cão
doméstico no Brasil, diagnosticado por Lopes (2006), um isolado de Babesia canis rossi, cedido pelo Prof. João Pessoa Araújo, do Laboratório de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biociências, UNESP-Botucatu e de um isolado de Cytauxzoon felis de uma onça-parda proveniente de Minas Gerais, diagnosticado por Metzger (2009). As amostras utilizadas como controle positivo foram previamente sequenciadas geneticamente, confirmando a especificidade da técnica.
Para as reações de PCR, utilizou-se termociclador Mastercycler Gradient, Eppendorf®
94°C por 30 segundos, 52°C por 20 segundos e 72°C por 20 segundos, seguidos por uma extensão final de 72°C por 7 minutos.
Como a PCR utilizada amplifica tanto o gênero Babesia spp. quanto Cytauxzoon spp., os dois piroplasmas foram diferenciados pela diferença de tamanho dos seus fragmentos na visualização do gel de agarose após eletroforese. Com a finalidade de confirmar o agente envolvido e identificar possível coinfecção com ambos os agentes, realizaram-se em todos os felídeos positivos dois protocolos de PCR, cada um amplificando separadamente Babesia canis vogelis e Cytauxzoon felis, como descrito abaixo.
Para o diagnóstico de Cytauxzoon felis, um fragmento de 284 pb da região do gene 18S
rRNA foi amplificado utilizando os oligonucleotídeos iniciadores 5’-
GCGAATCGCATTGCTTTATGCT-3’ e 5’-CCAATTGATACTCCGGAAAGAG-3’ (BIRKENHEUER et al. 2006), que correspondem às sequências conservadas de Cytauxzoon felis. A reação de amplificação foi realizada em um total de 25 µl, contendo: 1 x GO Taq Colorless Mastermix (Promega®), 10 pmol de cada oligonucleotídeo iniciador, 5 µl da amostra de DNA extraído e água ultrapura (MiliQ®) q.s.p. O controle negativo da reação não continha DNA e o controle positivo utilizado foi um isolado de Cytauxzoon felis proveniente de uma onça-parda diagnosticado por Metzger (2009).
As reações de PCR foram realizadas utilizando o termociclador Biometra thermal cycler (gradiente T), a 95°C por 5 minutos seguidos de 40 ciclos repetidos de 95°C por 45 segundos, 59°C por 45 segundos e 72°C por 60 segundos, seguidos por uma extensão final de 72°C por 5 minutos.
Para o diagnóstico de Babesia canis vogeli, realizou-se um PCR amplificando fragmentos da região do gene 18S rRNA, de aproximadamente 340 pb, utilizando os oligonucleotídeos
iniciadores 455-479 F (5’-GTCTTGTAATTGGAATGATGGTGAC-3’) e 793-772 R (5’-
ATGCCCCCAACCGTTCCTATTA-3’). Esse fragmento corresponde às sequências conservadas de Babesia gibsoni (AF 271081; AF 271082; AF 205636; AF 175300; AF 175301), Babesia canis vogeli (AJ 009796; AY 072925), Babesia canis canis (AY 072926; AJ 009795) e Babesia canis rossi (L 19079) (BIRKENHEUER; LEVY; BREITSCHWERDT, 2003).
A reação de amplificação foi realizada em um total de 25 µl, contendo: 1 x Go Taq Colorless Mastermix (Promega®), 10 pmol de cada oligonucleotídeo iniciador, 5 µl da amostra de DNA extraído e água ultrapura (MilliQ®) q.s.p. O controle negativo da reação não continha DNA e o controle positivo usado foi um isolado de Babesia canis vogeli de cão doméstico no Brasil, diagnosticado por Lopes (2006).
As reações de PCR foram realizadas utilizando o termociclador Mastercycler Gradient