2.3 Change in Organizations and Routines
2.3.1 Continuous Change
4.6.1 Cromatografia de afinidade em Tripsina-Sepharose
A cromatografia de afinidade foi feita através da ligação de tripsina bovina a resina de Sepharose 4B ativada com brometo de cianogênio, seguindo as instruções do fabricante. Para o seu preparo, pesou-se 1g da Sepharose para cada 3,5 mL de volume final de gel. O pó foi ressuspendido em 50 mL de HCl 1 mM e lavado por 15 min sendo filtrado várias vezes com auxílio de bomba a vácuo. O gel foi retirado do filtro, adicionou-se 15 mL de HCl 1mM e deixou-se em repouso por 15 min.
A tripsina utilizada para a ligação (FIGURA 17) foi preparada dissolvendo-se 10 mg de enzima, por mL de gel, em tampão bicarbonato de sódio, 100 mM, pH 8,3, contendo NaCl 500 mM. A solução de tripsina foi então adicionada ao gel e incubou- se por 16h a 4 °C. Decorrido o tempo, lavou-se o excesso d e ligante (tripsina) com 5 volumes de tampão bicarbonato de sódio, 100 mM, contendo NaCl 500 mM. Em seguida, o gel foi transferido para um recipiente contendo tampão tris-HCl, 100 mM, pH 8,0 por duas horas, para bloquear quaisquer grupos ativos remanescentes na resina. Decorrido esse tempo, o gel foi lavado com 5 volumes de tampão acetato de sódio, 100 mM, contendo NaCl 500 mM, pH 4,0, seguido por 5 volumes de tris-HCl, 100 mM, contendo NaCl 500 mM, pH 8,0. Após esse procedimento, o gel foi transferido para uma coluna (10 cm x 1,5 cm) e equilibrada com tampão tetraborato de sódio, 50 mM, pH 7,5.
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OH
O C N
Sepharose ativada com brometo de cianogênio
OH
O C N
OH
O C N
O C N
Sepharose ativada com brometo de cianogênio NH2 Tripsina NH2 NH2 TripsinaTripsina
OH
O C NH
NH
2 TripsinaOH
O C NH
NH
2 TripsinaOH
O C NH
NH
2NH
2 Tripsina Tripsina Tripsina Ligação isouréiaM ét od os 86
A fração JB14 (cerca de 13 mg de proteínas) dialisada contra tampão tetraborato de sódio, 50 mM, pH 7,5, proveniente da precipitação com solução aquosa de TCA 20%, foi submetida a cromatografia de afinidade em Tripsina- Sepharose (10 cm X 1,5 cm) equilibrada com tampão tetraborato de sódio, 50 mM, pH 7,5. As proteínas adsorvidas na matriz foram eluídas com solução de HCl 1mM. Frações de 2 mL foram coletadas em fluxo constante de 0,5 mL/min e o perfil cromatográfico das proteínas foi acompanhado por espectrofotometria a 280 nm. O pico adsorvido na matriz de afinidade, denominado JB14Af, foi dialisado e submetido a ensaio de atividade inibitória para tripsina.
4.6.2 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
A fração protéica de Jurema Branca obtida de coluna de afinidade em Tripsina-Sepharose foi analisada por CLAE em um cromatógrafo líquido LC-10A da
Shimadzu constituído por um sistema binário de bombeamento de solvente, detector
espectrofotométrico UV-Vis, injetor Rheodyne e uma estação de trabalho com aplicativo de controle do sistema (SCL – 10 Avp system controller) no Laboratório de Bioquímica de Proteínas e Peptídeos do Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Animal, Instituto Biológico, São Paulo. Para a análise inicial da fração protéica de Jurema Branca em CLAE, foram aplicados 5 µL de uma solução contendo 10 mg de proteína/mL. As condições analíticas iniciais consistiram, de uma maneira geral, no emprego de: coluna analítica de fase reversa C-18 (0,46 x 25,0
cm), diâmetro das partículas: 5 µm, diâmetro dos poros de 300 angstons); sistemas
de solventes constituído por: Solvente A; TFA 0,1% / H2O e solvente B contendo, ACN 60%/ TFA 0,09% /H2O (sistema TFA); gradiente de 5 a 35% de solvente B por 10 min; 35 a 60% em 25 min; 60 a 68 % em 5 min; de 68 a 88% em 20 min; 88 a 95% em 10 min; 95 a 5% em 2 min e 5% de B em 1 min; detecção em 220 nm e fluxo de 1 mL/min.
As condições experimentais determinadas nessas análises foram extrapoladas para uma escala de isolamento (FIGURA 18) dos componentes protéicos de Jurema Branca, utilizando uma coluna semi-preparativa de mesma polaridade que a empregada na escala analítica, medindo (2,2 x 25,0 cm); detecção
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em 220 nm e fluxo de 9 mL/min, onde foram aplicados cerca de 6 mg de proteína. Os picos protéicos isolados nessa fase de purificação foram liofilizados. Os liofilizados correspondentes aos picos protéicos foram denominados como JB1, JB2, JB3 e JB4. Essas frações foram recromatografadas utilizando-se coluna analítica (0,46 x 25,0 cm); detecção em 220 nm e fluxo de 1 mL/min; aplicação de volumes de 50 uL de cada fração contendo, aproximadamente, 50 ug de proteína. Para avaliar o grau de pureza de cada um dos inibidores, os gradientes de acetonitrila com variação de 1% de solvente B por min foram os seguintes:
Para JB1: 5% de solvente B em 5 min; 5 a 45% de solvente B em 5 min; 45 a 62 % de solvente B em 17 min; 62 a 95% de solvente B em 2 min; 95% de solvente B em 10 min; 95 a 5% de solvente B em 2 min e 5% de solvente B em 1 min.
Para a purificação de JB2: 5% de solvente B em 5 min; 5 a 55% de solvente B em 5 min; 55 a 75% de solvente B em 20 min; 75 a 95% de solvente B em 2 min; 95% de solvente B em 10 min; 95 a 5% de solvente B em 2 min; 5% de solvente B em 1 min.
Para JB3-1 e JB3-2: 5% de solvente B em 5 min; 5 a 62% de solvente B em 5 min; 62 a 77 % de solvente B em 15 min; 77 a 95% de solvente B em 2 min; 95% de solvente B em 10 min; 95 a 5% de solvente B em 2 min e 5% de solvente B em 1 min.
Para JB4: 5% de solvente B em 5 min; 5 a 80% de solvente B em 5 min; 80 a 100 % de solvente B em 20 min; 100% de solvente B em 10 min; 100 a 5% de solvente B em 2 min e 5% de solvente B em 1 min.
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FIGURA 18: Esquema de isolamento e purificação dos inibidores de tripsina de sementes de Jurema Branca
Fração protéica (JB14)
Coluna de afinidade em Tripsina-Sepharose (10 x 1,5 cm)
Fraçãos de 2 mL em fluxo constante de 0,5 mL/min (D. O. 280 nm) Tampão de equilíbrio: tampão tetraborato de sódio, 50 mM, pH 7,5 Frações adsorvidas eluídas com HCl 1 mM
Cromatografia líquida de alta eficiência – CLAE
Coluna semi-preparativa (2,2 x 25,0 cm) para isolamento dos inibidores
(D. O. 220 nm), Solvente B (ACN 60%/ TFA 0,09% /H2O), Fluxo de 9 mL/min
Fração protéica (JB14Af)
Farinha de sementes de Jurema Branca
Extrato bruto (EB)
Extração: tampão tetraborato de sódio, 50 mM, pH 7,5
Tempo de extração: 3 horas.
Proporção (1:10, m/v), farinha: meio de estração
Centrigufação: 12000 x g – 30 min, 4 0C.
Precipitação protéica com solução aquosa de TCA
Adição de TCA aquoso para concentração final de 14% em banho de gelo,
reservado a 5 0C, por 30 min.
Centrigufação: 12000 x g – 30 min, 4 0C.
Precipitado
Precipitado Sobrenadante
Diálise contra tampão tetraborato de sódio, 50 mM, pH 7,5
JB1 JB2 JB4
JB1 JB2 JB3 JB4
JB3-1 JB3-2
Cromatografia líquida de alta eficiência – CLAE
Coluna analítica (0,46 x 25,0 cm) para avaliar o grau de pureza dos inibidores
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