3 Phases of capacity in Norwegian fisheries
3.2 Catch capacity and modern fishing industry
Para o grupo controle as células foram cultivadas em duas placas de 6 poços (TPP, Trasadingen, Schaffhausem, Suíça) contendo 2 ml de meio de cultura DMEM/F12 completo por 21 dias, sendo então mantidas em incubadora úmida a 37º C e 5% de CO2 e o meio de cultura trocado a cada 3 dias. Após esse período, o meio foi removido por sucção e as células lavadas duas vezes com PBS. Imediatamente após foi utilizado 2 ml de uma solução fixadora de paraformaldeido 0,4% em PBS (Electron Microscopy Sciences, Hartfield, Pennsylvania, EUA). Após 30 min a solução fixadora foi removida por sucção e as células lavadas três vezes com PBS. A seguir: as células foram incubadas por 10 min em PBS contendo 0,1 M de glicina sendo posteriormente lavadas duas vezes apenas em PBS por 2 min.
Posteriormente, as células foram incubadas com o corante hematoxilina (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA) a temperatura
ambiente por 30 min. A solução corante foi removida cuidadosamente com auxílio de uma pipeta descartável de 2 ml e lavada cinco vezes com 2 ml de água corrente para retirar o excesso de corante. A seguir, as células foram incubadas com o corante eosina em PBS por 2 min e as células foram novamente lavadas três vezes com água corrente para retirar o excesso do corante. A placa com as células fixadas e coradas foi observada no microscópio de epifluorescência Nikon Ti-U e fotografadas utilizando o Software NIS-Elements - 3.2 (Nikon Instruments INC, Melville, New York, EUA). O referido equipamento foi adquirido no subprojeto “Avaliação funcional e morfológica de células em regeneração tecidual ecto e mesodérmica”, coordenado pela Profa. Dra. Lydia Masako Ferreira (Edital Capes nº 27/2010 - Pró-Equipamentos Institucional).
4.4.1 Diferenciação adipogênica
Para a diferenciação adipogênica, as células foram cultivadas em duas placas de 6 poços (TPP, Trasadingen, Schaffhausem, Suíça) contendo 2 ml de meio de cultura DMEM/F12 completo suplementado com 10 µM insulina e 1 µM de dexametasona (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA) por 15 dias, sendo então mantidas em incubadora úmida a 37º C e 5% de CO2 e o meio de cultura trocado a cada 3 dias. Após esse período, o meio foi removido por sucção e as células lavadas duas vezes com PBS. Imediatamente após foi utilizado 2 ml de uma solução fixadora de paraformaldeido 0,4% em PBS (Electron Microscopy Sciences, Hartfield,
Pennsylvania, EUA). Após 30 min a solução fixadora foi removida por sucção e as células lavadas três vezes com PBS como descrito a seguir: uma vez em PBS contendo 0,1 M de glicina por 10 min e duas vezes apenas em PBS por 2 min.
Posteriormente, as células foram incubadas com o 0,5% de corante Oil Red O (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA) a temperatura ambiente por 30 min. A solução corante foi removida cuidadosamente com auxílio de uma pipeta descartável de 2 ml e lavada cinco vezes com 2 ml de água corrente para retirar o excesso de corante. A seguir, as células foram incubadas com 1µg/ml do corante (4’,6-diamidino-2 fenilindole), dihidrocloride (DAPI) (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA) em PBS (0,1% de BSA (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA) e 0,2 % de saponina (Calbiochem, Darmstadt, Hessen, Alemanha) por 2 min e as células foram novamente lavadas três vezes em PBS. A placa com as células fixadas e coradas foi observada no microscópio de epifluorescência Nikon Ti-U e fotografadas utilizando o Software NIS-Elements - 3.2 (Nikon Instruments INC, Melville, New York, EUA).
4.4.2 Diferenciação osteogênica
Para diferenciação osteogênica, as células foram cultivadas em duas placas de 6 poços (TPP, Trasadingen, Schaffhausen, Suíça) contendo 2 ml de meio de cultura DMEM/F12 completo suplementado com 50µM de ácido ascórbico (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA) ®), 0,1µM de
dexametasona e 10-2M de β glicerofosfato (Mallinckrodt Baker, Phillipsburg, New Jersey, EUA) por 21 dias, sendo então mantidas em incubadora úmida a 37º C e 5% de CO2 e o meio de cultura trocado a cada 3 dias. Após esse período, o meio foi removido por sucção e as células lavadas duas vezes com PBS. Imediatamente após foi utilizado 2 ml de uma solução fixadora paraformaldeido 0,4% em PBS. Após 30 min a solução fixadora foi removida por sucção e as células lavadas três vezes com PBS como descrito a seguir: uma vez em PBS contendo 0,1 M de glicina por 10 min e duas vezes apenas em PBS por 2 min.
Posteriormente, as células foram incubadas com uma solução de 40 mM de alizarina vermelha sódica (pH 4.1) (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA) a temperatura ambiente por 30 minutos. A solução corante foi removida cuidadosamente com auxílio de uma pipeta descartável de 2 ml e lavada 5 vezes com 2 ml de água corrente para retirar o excesso de corante. A seguir, as células foram incubadas com 1µg/ml do corante DAPI em PBS (0,1% de BSA e 0,2 % de saponina) por 2 min e as células foram novamente lavadas três vezes em PBS. A placa com as células fixadas e coradas foi observada no microscópio de epifluorescência Nikon Ti-U e fotografadas utilizando o Software NIS-Elements - 3.2 (Nikon Instruments INC, Melville, New York, EUA)
Para diferenciação condrogênica, as células foram cultivadas em duas placas de 6 poços (TPP, Trasadingen, Schaffhausen, Suíça) contendo 2 ml de meio de cultura DMEM/F12 completo suplementado com 10 µM insulina, 0,1 µM de dexametasona, 50µM de ácido ascórbico e 10ng/ml TGF-β1 (Cell Signaling Technology, Beverly, Massachusetts, EUA) por 21 dias, sendo então mantidas em incubadora úmida a 37º C e 5% de CO2 e o meio de cultura trocado a cada 3 dias. Após esse período, o meio foi removido por sucção e as células lavadas duas vezes com PBS. Imediatamente após foi utilizado 2 ml de uma solução fixadora formalina 0,4% em PBS paraformaldeido 0,4% em PBS. Após 30 min a solução fixadora foi removida por sucção e as células lavadas três vezes com PBS como descrito a seguir: uma vez em PBS contendo 0,1 M de glicina por 10 min e duas vezes apenas em PBS por 2 min.
Posteriormente, as células foram incubadas com uma solução 0,1% de azul de Toluidina (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA) a temperatura ambiente por 30 minutos. A solução corante foi removida cuidadosamente com auxílio de uma pipeta descartável de 2 ml e lavada 5 vezes com 2 ml de água corrente para retirar o excesso de corante. A placa com as células fixadas e coradas foi observada no microscópio de epifluorescência Nikon Ti-U e fotografadas utilizando o Software NIS- Elements - 3.2 (Nikon Instruments INC, Melville, New York, EUA).