Bildebruk i ”Dresden utslettes 13.-14. februar 1945”

A glicose éa principal fontede energia eé umsubstratoimportante paraa síntese deproteínas elipídeosem células de mamíferos. Ela forneceenergia na formade ATPatravés da glicólise e do ciclo de ácidocítrico (ciclo de Krebs) e na forma de NADPHpela via da pentose fosfato. Também é utilizada na síntese de glicerol e para a produção de triglicérideos e proporciona intermediários para a síntese de aminoácidos não essenciais (ZHAO; KEATING, 2007).

Nos mamíferos, uma vez que os níveis de glicose no sangue estejam mantidos dentro de uma estreita gama de mecanismos de homeostase, a maioria das células recebe glicose a partir do fluido intersticial por um processo de transporte passivo, a difusão facilitada, impulsionada pelo gradiente de concentração para o interior celular através da membrana plasmática (WIDDAS, 1988).

Apenas em células epiteliais com bordas em escova do intestino delgado e dos túbulos contorcidos proximais dos rins, a glicose é absorvida, ou reabsorvida, contra o seu gradiente eletroquímico por um mecanismo de transporte ativo secundário, a bomba de sódio e potássio (ZHAO; KEATING, 2007).

Os processos de transporte de glicose são mediados por duas famílias distintas de transportadores de glicose estruturalmente relacionados. O processo de transporte passivo facilitado é mediado pela família das proteínas facilitadoras do transporte de glicose (GLUTs) e o transporte ativo é mediado pela família de proteínas co-transportadoras dependentes de sódio (SGLTs), que apresenta seis membros, porém apenas SLGT1 e SLGT2 já são bem caracterizadas (JOOST et al., 2002; WRIGHT; TURK, 2004; MACHADO; SCHANN; SERAPHIM, 2006).

As GLUTs apresentam peso molecular entre 50 e 60 kDa e são denominadas GLUT-1 a 12, HMIT-H+- ligado ao mio-inositol e GLUT14 de acordo com a ordem cronológica de caracterização (WU; FREEZE, 2002; SCHEEPERS; JOOST; SCHURMANN, 2004; MACHADO; SCHANN; SERAPHIM, 2006;). A GLUT-1 se apresenta, em humanos, com 492 aminoácidos e peso molecular de aproximadamente 54kDa (ZHAO; KEATING, 2007).

Uma ampla pesquisa do genoma no GenBank indicou que as GLUT1-12 e HMIT podem representar todos os membros de facilitadores do transporte passivo de glicose em humanos (JOOST; THORENS, 2001).

Estas proteínas são estruturalmente semelhantes e relacionadas. A análise destas proteínas indica que esta família de transportadores apresenta uma estrutura terciária de 12 domínios transmembranares hidrofóbicos. Esses domínios são conectados por segmentos hidrofílicos intra e extracelulares e possuem porções

terminais NH2 e COOH citoplasmáticas (Figura 1) (THORENS; CHARRON; LODISH

1990; JOOST; THORENS, 2001; MACHADO; SCHANN; SERAPHIM, 2006).

Figura 1- Estrutura molecular bidimensional da GLUT.

Fonte: Adaptado de Machado, Schaan e Seraphim, 2006.

Comparações de sequência de todos os membros da família mostram que as sequências são mais conservadoras nas regiões transmembranares, sugerindo que esses domínios são responsáveis pela característica comum a todas as GLUTs, que é a capacidade de transportar a glicose, e mais divergente nas regiões de loops e regiões C e N-terminais (KASANICH; PILCH; 1990; ZHAO; KEATING, 2007).

Estes dados sugerem que os aminoácidos conservados desempenham papéis importantes na ligação ao substrato e/ou na alteração de conformação durante o processo de transporte. Ademais, a presença de áreas comuns sugere que esta família pode ter origem a partir de um gene ancestral comum (ZHAO; KEATING, 2007).

As regiões mais divergentes são os loops 1 e 9 e as duas regiões terminais, seugerindo que esses domínios sejam responsáveis pela especificidade de cada isoforma, tais como localização celular, características cinéticas, regulação hormonal e imunogenicidade. (KASANICH; PILCH; 1990; ZHAO; KEATING, 2007).

Além disso, há 18 resíduos de glicina conservados, 11 dos quais são adjacentes a um ou mais aminoácidos conservados. Experimentalmente, um triptofano do domínio transmembrana (TM10) tem sido demonstrado ser essencial para a ligação da GLUT-1 aos ligantes da citocalasina B e forscolina. E o triptofano conservado em todas as GLUTs no domínio transmembrana 11 é essencial para o transporte de glicose pela GLUT-1 através da membrana plasmática (GARCIA et al., 1992; SCHURMANN et al., 1993). Além da glicose, a GLUT1 também transporta galactose, manose e glicosaminas (ULDRY et al., 2002).

A troca da arginina conservada no loop 2, duas argininas em loop 8, glutamato em loop 8, prolina no domínio transmembrana 10, glutamato ou arginina no loop 10 reduz ou suprime a atividade de transporte de glicose da GLUT-1 (MORI et al., 1994; SCHURMANN et al., 1997). Os últimos 24 aminoácidos na região C- terminal da GLUT-1 demonstraram ser desnecessários para a atividade de transporte (MURAOKA, 1995).

A GLUT-1 é altamente expressa em endotélio microvascular de tecidos de barreira, onde o fluxo seletivo de glicose do sangue para os tecidos é de extrema importância, tais como sistema nervoso central (SNC), retina, íris, músculo ciliar, endoneuro de nervos periféricos e placenta (TAKATA et al., 1990; YOUNES et al., 1997; NORTH et al., 2000; WOOD; TRAYHURN, 2003). A GLUT-1 pode desempenhar um papel vital para a entrada de glicose nesses tecidos firmemente protegidos (TAKATA et al., 1990).

Também é observada expressão em eritrócitos, correspondendo a cerca de 5% das proteínas de membrana deste tipo celular, centros germinativos dos tecidos linfoides e túbulos renais, além de tecido adiposo e algumas células hepáticas (TAKATA et al., 1990; YOUNES et al., 1997; WOOD; TRAYHURN, 2003; ZHAO; KEATING, 2007).

Hogan, Gjedde e Hakim (1991) em seu estudo, coletaram embriões de ratos antes da implantação do zigoto, entres os estágios de ovócito e blastocitso, e identificaram a presença da isoforma 1 da GLUT em quase todos os tecidos examinados, incluindo cérebro e eritrócitos.

Essa proteína não é expressa na vasculatura de qualquer outro tecido normal ou tumor vascular. Não apresenta relação com atividade mitótica e é considerado um marcador sensível e específico para diagnóstico do HI mostrando-se presente em todas as suas diferentes fases evolutivas (ENJOLRAS; MULLIKEN, 1997;

ENJORAS; WASSEF; CHAPOT, 2013). Células da placenta e de HIs parecem ter o mesmo ciclo de vida, o que sugere que os HI podem resultar de células placentárias embolizadas (NORTH et al., 2001a). Células progenitoras que podem ter origem a partir da placenta são encontradas dentro da anomalia (LO; MIHM; FAY, 2009; NORTH et al., 2001a).

North et al. (2000) realizaram um estudo sobre a marcação imunoistoquímica de GLUT-1 em diferentes anomalias vasculares. Eles encontraram intensa imunorreatividade para GLUT-1 nos HIs, demonstrando mais de 50% de marcação nas células endoteliais dos microvasos lesionais em 97% dos casos. Além disso, não foi observada imunorreatividade para GLUT-1 em nenhum caso de MVs, GPs e hamangioendoteliomas. Esses achados estabeleceram a GLUT-1 como um marcador altamente sensível e específico para a identificação de HIs de qualquer órgão.

Em seu estudo, North et al. (2001b) objetivaram comparar as características histológicas e imunoistoquímicas dos HIs e HCNIs. Foram utilizados no estudo 43 lesões obtidas a partir de 36 pacientes, incluindo 25 casos de HIs, 10 GPs, 1 angioma em tufo, 1 hemangioendotelioma kaposiforme infantil e 6 casos de HCNIs de pacientes com até 4 meses de idade. Foi então realizada a análise imunoistoquímica fazendo-se uso dos antígenos GLUT-1 e LeY e foi verificado que 100% dos HIs demonstravam imunpositividade para ambos os marcadores e, de maneira adversa, nenhum dos outros casos demonstrou tal positividade. Foram observadas também diferenças histopatológicas entre os HIs e os HCNIs. Os autores concluíram que os HCNIs são histologicamente e imunofenotipicamente diferentes dos HIs e que esses dois tipos de tumores representam entidades diferentes, apesar de algumas similaridades clínicas.

MO et al. (2004) verificaram que havia deficiência de uma terminologia adequada para as anomalias vasculares hepáticas. Diante disso realizaram um estudo com 19 casos utilizando diversos marcadores vasculares, incluindo a GLUT- 1. Seus resultados indicaram que há dois distintos grupos de lesões vasculares hepáticas em neonatos e crianças, o HI hepático, que apresenta positividade para GLUT-1, e as MV hepáticas que são GLUT-1 negativas. Desta maneira os autores concluíram que a GLUT-1 se apresenta como uma eficiente ferramenta na distinção entre HIs e MVs hepáticos.

Nguyen et al. (2004), observaram em seu estudo, uma intensa marcação para GLUT-1, em células endoteliais de todos os casos de HIs localizados em tronco, genitália e na cabeça, incluindo 4 casos em boca (2 casos no lábio e 2 em mucosa jugal).

Johann et al. (2007), objetivando verificar a acurácia do diagnóstico histológico de “hemangiomas”, MVs e GPs orais, investigaram a imunoexpressão da GLUT-1 nessas anomalias. Foram utilizados 19 casos de hemangiomas, 48 GPs e 17 MVs orais. Foi observado que nenhum dos casos de lesões vasculares benignas orais apresentou imunopositividade para GLUT-1. Os 19 casos diagnosticados inicialmente como hemangiomas orais mostraram negatividade para GLUT-1, sendo então reclassificados como GPs ou MVs, através de uma análise mais detalhada dos casos. A análise histológica não foi suficiente para concluir o diagnóstico dos HIs pelo fato de nenhum desses se tratar HI verdadeiro. Além disso, todos os casos que foram inicialmente classificados como GPs e MVs foram imunonegativos para esta proteína, o que demonstrou a eficácia da análise histológica para estas lesões. Dessa maneira, os autores concluíram que a GLUT-1 se trata um marcador efetivo no auxílio para a definição do diagnóstico das lesões vasculares benignas orais.

Browning et al. (2009) diante do fato de que GPs em infantes são comumente confundidos com HIs, realizaram uma análise imunoistoquímica fazendo-se uso do marcador GLUT-1. Em ambos os casos não foi observada a imunopositividade para o marcador, dando suporte à manutenção do GP como diagnóstico apropriado.

Song et al. (2011) realizaram um estudo na tentativa de distinguir HCNIs de HIs através de estruturas histopatológicas e da imunoexpressão de GLUT-1. Foram incluídos no estudo 13 casos de HCNI, 13 casos de HI em proliferação e 13 casos de HI em involução coletados através de biópsias. Nos casos de HCNI, os lóbulos de capilares se mostravam bem definidos, cercados por tecido fibroso abundante, com os vasos capilares íntegros, por vezes, de calibres aumentados. Figuras de mitose e corpos apoptóticos eram vistos eventualmente em células endoteliais e estromais. Os achados patológicos dos HIs, segundo ou autores, eram totalmente diferentes. A análise muno-histoquímica revelou que a GLUT-1 foi expressa nas células endoteliais dos HIs, mas nos casos de HCNI essa expressão não foi observada.

Osaki et al. (2013) realizaram um estudo com anomalias vasculares orbitais. Foram utilizados no estudo 10 casos de HIs e 10 casos de “lesão venosa

encapsulada cavernosa” ou MVs orbitais. Foi observado que todos os casos de HIs apresentaram positividade para GLUT-1, enquanto que nenhum dos casos de MVs apresentou tal positividade. De acordo com os autores, a imunopositividade para GLUT-1 observada apenas nos HIs destacou uma diferença essencial, uma vez que, este marcador melhorou a precisão diagnóstica, principalmente quando as áreas sólidas dos HIs, em fase tardia, sofrem transformação em canais vasculares ectásicos, mas ainda assim apresentam-se GLUT-1 positivas.

Oliveira et al. (2014) em seu estudo analisaram a expressão imunoistoquímica de 30 casos diagnosticados inicialmente como “hemangiomas” e 30 casos diagnosticados como GP orais. A partir do teste imunoistoqúimico foi verificado que apenas 7 dos casos de “hemangiomas” tratavam-se de HIs verdadeiros, enquanto que os outros 23 casos não apresentaram positividade para GLUT-1. Os espécimes GLUT-1 negativos foram então reclassificados em GP (10) e MV(13) orais. Nenhum dos casos de GP apresentou positividade para GLUT-1, sendo então mantido o seu diagnóstico histológico inicial. Dessa maneira, os autores concluíram que apenas as características histopatológicas não são suficientes para o correto diagnóstico dos HIs orais.

2.5 Ki-67 e Bcl-2

A proliferação celular é um processo biológico de fundamental importância para todos os seres vivos por seu importante papel na homeostase tecidual e é controlada por mecanismos altamente coordenados. Progressos substanciais na compreensão dos mecanismos e da regulação do ciclo celular foram feitos nos últimos anos e verificou-se que numerosas moléculas são associadas ao ciclo celular e suas modulações (SCHLÜTER et al., 1993; BOLOGNA-MOLINA et al., 2012).

O ciclo celular é constituído por uma série de fases, durante a qual ocorrem alterações que conduzem a divisão celular. Genes de células reguladoras modulam o ciclo celular de uma forma altamente sofisticada através de uma variada quantidade de proteínas (SCULLY; FIELD; TANZAWA, 2000).

Marcadores de proliferação referem-se a proteínas específicas ou outros fatores cuja presença em células em divisão serve como um indicador de crescimento ativo para tais células. Hoje em dia, o método mais comum para a

determinação da atividade proliferativa é a utilização de técnicas imunoistoquímicas, que são cada vez mais aplicadas na rotina patológica. (BOLOGNA-MOLINA et al., 2012).

Em 1983, um anticorpo monoclonal (mAb), designado Ki-67, que reage seletivamente com os núcleos das células em proliferação em todos os tecidos humanos testados foi descrito (GERDES et al., 1983). Trata-se de um marcador clássico de proliferação celular, que tem sido amplamente aplicado nos campos de pesquisa de diagnóstico. O anticorpo padrão para a detecção de Ki-67 é o MIB-1 (BOLOGNA-MOLINA et al., 2012).

Análises detalhadas do ciclo celular revelaram que este antígeno associado à proliferação é expresso em todas as partes ativas do ciclo celular (G1, S, G2, e mitose), mas está ausente na fase de repouso (G0), indicando que o antígeno Ki-67 pode ser utilizado como um marcador para as células em proliferação (GERDES et al., 1984; KIM et al., 2012).

O controle deste importante processo é completamente desregulado em alguns tipos de neoplasias. Em consequência, a determinação da fase de crescimento com o antígeno Ki-67 tem sido largamente utilizada na histopatologia, particularmente em numerosos estudos sobre o valor prognóstico da avaliação da proliferação de células em amostras clínicas de neoplasmas humanos (SCHLÜTER et al., 1993; BOLOGNA-MOLINA et al., 2012)

Na fase G1, o antígeno Ki-67 é predominantemente localizado na região perinucleolar e, nas últimas fases do ciclo celular, é detectado também em todo o interior nuclear, sendo predominantemente localizado na matriz nuclear. Na mitose, está presente em todos os cromossomos e aparece em uma estrutura reticulada que envolve os cromossomos metafásicos (VERHEYEN et al., 1989; GERDES et al, 1984; SCHLÜTER et al., 1993;).

Em contraste com muitas outras proteínas celulares associadas ao ciclo celular, o antígeno Ki-67 é ausente em células quiescentes e não é detectável durante os processos de reparação do DNA. Assim, a presença do antígeno Ki-67 é estritamente associada com o ciclo celular e confinada ao núcleo, sugerindo um papel importante desta estrutura para a manutenção e/ou regulação do ciclo de divisão celular (SCHLÜTER et al., 1993; KIM et al., 2012;).

North et al. (2000) em seu estudo analisaram a possibilidade de haver alguma analogia entre o marcador GLUT-1 e a atividade proliferativa medida pela

imunomarcação para KI-67. Os autores encontraram em seus resultados que a expressão de GLUT-1 não apresenta ligação direta com o marcador de proliferação Ki-67, uma vez que HIs GLUT-1 positivos, em fase tardia, apresentavam pouca, ou nenhuma, imunorreatividade para KI-67 ou figuras de mitose aparentes, no entanto demonstravam intensa marcação para GLUT-1. Em contraste, células endoteliais de amostras de GP e tecido de granulação apresentavam intensa imunorreatividade para Ki-67, mesmo sendo observada completa ausência de marcação para GLUT-1 nessas lesões.

Em seu estudo, Nakurama (2000) comparou a imunoexpressão de Ki-67 em GPs, “hemangiomas capilares” e amostras de tecido de granulação, onde apresentou marcação com intensidade variável sem diferença estatisticamente significativa entre as lesões.

Dyduch et al. (2004) também tentaram estabelecer uma ligação entre GLUT-1 e Ki-67. Em seu estudo foram utilizados 26 casos de “hemangioma capilar infantil” (HI), 15 de “hemangioma capilar lobular” (GP) e 9 de “hemangiomas epitelióides” da pele. Os autores encontraram uma relação inversamente proporcional da expressão desses marcadores, no entanto, tal relação não apresentava significância estatística. Dessa maneira, os autores concluíram que a expressão da GLUT-1 nas anomalias vasculares não era dependente do seu potencial proliferativo.

Apesar de as MVs serem consideradas um tipo de anomalia vascular sem a presença de proliferação endotelial, Meijer-Jorna et al. (2012) demonstraram que áreas de vasos imaturos dentro das malformações vasculares podem apresentar imunopositividade para o Ki-67, sugerindo que essas áreas podem apresentar o mesmo padrão de proliferação celular e maturação que é observado em outras lesões vasculares de pele e mucosa, como o GP e o HI de quaisquer órgãos.

O comportamento biológico de qualquer lesão é altamente dependente da sua atividade proliferativa (REZVANI et al., 2010; RANJBARI; RAHIM, 2013). No entanto, a taxa de crescimento das lesões depende não apenas do nível de proliferação das células tumorais, mas também das taxas de morte celular (NAKAMURA, 2000).

A apoptose é a via de morte celular que é induzida por um programa intracelular altamente regulado, onde as células que estão destinadas a morrer ativam enzimas que degradam seu material nuclear e as proteínas citoplasmáticas (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2010).

Ela é caracterizada morfologicamente por encolhimento da célula, condensação e marginação da cromatina nuclear, brotamento da membrana celular, fragmentação celular formando corpos apoptóticos e ausência de uma reação inflamatória (IWATA et al., 1996). A membrana plasmática da célula permanece intacta, mas sua estrutura é alterada de forma que a célula apoptótica se torna um alvo primário da fagocitose. A célula morta é eliminada rapidamente, antes que seu conteúdo possa extravasar e, dessa forma, não desencadeia uma reação inflamatória pelo hospedeiro (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2010).

Bioquimicamente, o DNA de células apoptóticas é clivado devido à ativação de endonucleases. A apoptose desempenha um papel importante na morfogênese fetal e em várias condições fisiológicas e patológicas. Vários fatores têm sido propostos como reguladores deste fenômeno. O antígeno Fas, e a proteína p53 estimulam a apoptose, enquanto que a proteína Bcl-2 a inibe (IWATA et al., 1996).

A apoptose é uma forma de morte celular com características diferentes das da necrose, que é caracterizada pela perda da integridade das membranas, digestão enzimática das células e ocorre reação inflamatória do hospedeiro. (IWATA et al., 1996; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2010).

A proliferação e regressão das células endoteliais são rigidamente controladas por mecanismos fisiopatológicos sob várias condições. No entanto, em células neoplásicas, que se caracterizam pelo crescimento excessivo descontrolado, o equilíbrio entre a proliferação e morte celular é interrompido (NÖR et al., 2001).

A família Bcl-2, um grupo de proteínas reguladoras, controla a via central apoptótica e protege as células, através da via mitocondrial, de uma variedade de estímulos apoptóticos (MURAKAMI et al., 2008). Esta família inclui proteínas antiapoptóticas, tais como Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, Bcl-B e A1 e pró-apoptóticas, como Bax, Bcl-xS, Bad e Bim. A apoptose é regulada por estas proteínas através de mecanismos que envolvem alterações na permeabilidade da membrana mitocondrial externa (COLITTI, 2012).

A sequência de aminoácidos homólogos de ambos os membros antiapoptóticos e pró-apoptóticas é confinada a quatro regiões específicas chamadas de domínios homólogos Bcl-2 (BH1-4). Estes domínios são essenciais para a função destas proteínas, incluindo o seu impacto sobre a sobrevivência das células e a sua capacidade de interagir com outros membros da família e proteínas reguladoras, de modo a formar homo ou heterocomplexos (HIROTANI et al., 1999)

As proteínas também contêm um domínio C-terminal hidrofóbico, que acredita-se estar envolvido na orientação das proteínas de membranas intracelulares (COLITTI, 2012)

As proteínas multidomínios antiapoptóticas residem principalmente na mitocôndria e possuem quatro ou dois domínios BH. Os domínios BH1 e BH2 são necessários para a proteína Bcl-2 e Bcl-xL interagir com Bax e para suprimir a apoptose. Nas proteínas pró-apoptóticas, o domínio BH3 foi demonstrado ser necessário para a sua atividade de morte. Como especialmente demonstrado por uma abordagem genética, o BH3 não só neutraliza os membros da família Bcl-2 antiapoptóticos, mas também pode ativar diretamente Bax ou Bak, que são componentes essenciais da via de apoptose mitocondrial (COLITTI, 2012; MERINO et al., 2009; WEI et al., 2001).

A proteína Bcl-2 prolonga a sobrevida celular, no entanto, não dispõe de vantagens proliferativas. Num contexto adverso, as células que expressam Bcl-2, consequentemente demonstram um potencial de resistência à apoptose, podendo apresentar a supressão da morte celular programada, adquirir mutações e culminar com a progressão tumoral (FARIAS; SOUZA; AARESTRUP, 2005).

Itawa et al. (1996) em seu estudo comparando taxa de proliferação e apoptose em “hemangioma capilar infantil” (HI) e “hemangioma capilar lobular” (GP) verificaram marcação positiva para o antígeno de proliferação Ki-67 sem diferenças significativas entre os grupos. E, ao mesmo tempo, encontraram nenhuma ou muito pouca expressão de Bcl-2 em ambos os grupos. Por outro lado, fazendo uso do antígeno Lewisy_{, um marcador pró-apoptótico, foi observado marcação positiva para}

HI e negativa para GP, sugerindo a apoptose como a causa da involução espontânea dos HIs observados.