Betydningen av brukernes innstillinger, ildsjeler og behov

Esse estudo teve como objetivo avaliar os três novos transcritos 2E07, 11A01 e 13A12 no processo parasítico de M. incognita. Para isso, os transcritos foram silenciados em M. incognita por intermédio do mecanismo de RNA – Interferente e, adicionalmente, uma construção contendo o gene 2E07 fusionado a GFP foi gerada para expressar ectopicamente a proteína 2E07 em plantas de tabaco com o objetivo de avaliar seus efeitos nas raízes do hospedeiro. A proteína 2E07 foi primeiramente isolada e descrita por HUANG et al. (2003), a

partir de uma biblioteca de cDNA produzida das glândulas esofágicas de M. incognita. A identificação e caracterização de genes de nematóides parasitas de plantas é uma excelente estratégia para se estudar os processos biológicos vitais do ciclo de vida desses fitopatógenos, bem como para melhor compreender as interações desses parasitas com seus hospedeiros (GHEYSEN, 2007). Além de serem pioneiros, os genes selecionados no presente estudo são exclusivamente expressos na glândula dorsal de M. incognita como demonstrou o resultado da hibridização in situ (ver figura 3). Nas bibliotecas que incluem apenas genes especificamente expressos nas glândulas esofagianas de M. incognita e H. glycines, o percentual de seqüências pioneiras atinge cerca 89% e 72%, para as duas espécies, respectivamente (GAO, 2003; HUANG, 2003), indicando que grande parte dos genes expressos nas glândulas esofagianas destas espécies de fitonematóides é constituída de proteínas novas, sem domínios e seqüências conhecidas, o que não nos permite classificá-las funcionalmente em famílias gênicas específicas.

As seqüências descritas por HUANG et al. (2003), indicam que os transcritos 11A01 e 13A12, possuem 89% e 90%, respectivamente, de identidade com a seqüência 2E07. A partir da similaridade das seqüências nucleotídicas (ver figura 1-A) e de aminoácidos (ver figura 1- B) e da análise da comparação destas, este trabalho sugere que os transcritos 2E07, 11A01 e 13A12 são originados a partir de dois genes, sendo um gene traduzido na proteína 2E07 e o outro traduzido nas proteínas 11A01 e 13A12, as quais são geradas a partir do splicing alternativo na região C-terminal deste gene. O splicing alternativo produz diferentes proteínas a partir de um mesmo gene, é um mecanismo extremamente importante para o aparecimento de novas proteínas funcionais ativas(ALBERTS, 2002). Os genes 2E07 e 11A01/13A12 são provavelmente homólogos devido à reprodução partenogênica mitótica desses nematóides. Esse tipo de reprodução consiste em uma reprodução assexuada onde a multiplicação e divisão celular é feita por meio da mitose, sendo assim, a progênie é um clone da mãe. A similaridade das seqüências de aminoácidos (ver figura 1-B) dessas três proteínas 2E07, 11A01 e 13A12 sugere que estas provavelmente possuem uma função parecida, mas que devido a poliadenilaçao alternativa, a proteína 2E07, em relação as outras duas é regulada de maneira diferente. Como o splicing alternativo, a poliadenilação alternativa contribui para a complexidade do transcriptoma em células eucarióticas, por meio da produção de mRNAs com diferentes regiões 3’ não traduzidas (3’UTR) e / ou a codificação de variáveis isoformas protéicas (EDWALDS-GILBERT, 1997). A regulação da 3’UTR pela poliadenilação alternativa pode ter um impacto diferente sobre o metabolismo do mRNA, já que a 3’UTR pode conter vários elementos reguladores, como elemento ricos em AU, responsáveis pela

estabilidade do mRNA (WILUSZ, 2004), e seqüências alvos para miRNAs envolvidos na regulação da tradução do mRNA (BARTEL, 2004). O efeito da poliadenilação alternativa sobre a codificação de proteínas é normalmente acompanhado por splicing alternativo, e tem sido demonstrado para vários genes (EDWALDS-GILBERT, 1997). Sabe-se que muitos sítios de poliadenilaçao são preferencialmente utilizados em certos tecidos e sob específicas condições celulares (EDWALDS-GILBERT, 1997), sendo genes regularmente expressos de maneira diferente.

Neste trabalho, foi utilizada uma construção com o gene 2E07 em fusão com o gene repórter GFP, a fim de se localizar a proteína 2E07 nas raízes das plantas de tabaco. Entretanto, o nível baixo da expressão dessa proteína fusionada 2E07–GFP e devido às plantas de N. tabacum controles e transformadas apresentarem uma fluorescência endógena similar ao comprimento de onda do GFP, nos não conseguimos distinguir e detectar a fluorescência do GFP nos eventos trangênicos utilizando microscopia confocal (ver figura 7- A, 7-B). Por outro lado, o Dot Blot utilizando uma concentração oito vezes mais alta de extratos de raiz em relação ao primeiro ensaio, confirmou a presença da proteína GFP nos extratos das raízes das plantas trangênicas 2E07-GFP (ver figura 8). A baixa expressão do GFP e provavelmente da proteína 2E07 nas plantas transformadas pode ser explicado devido a alguns fatores; primeiramente as análises terem sido feitas em linhagens T1 de plantas transgênicas. A expressão do GFP é melhor observada em linhagens T2, devido a homozigose da construção nos cromossomos, a qual gera uma maior expressão da proteína GFP, ocasionado pela tradução de um número maior de cópias do gene no DNA da planta e consequentemente, uma maior fluorescência no tecido observado. Outro fator a ser considerado, é a posição no cromossomo onde o T-DNA carreando o gene 2E07 foi inserido, este pode ter sido inserido em uma região pouco expressa no cromossomo, como por exemplo, em regiões onde a heterocromatina é mais densa, gerando assim uma baixa expressão da proteína 2E07–GFP nas plantas de N. tabacum transformadas.

Apesar da baixa concentração do GFP e provavelmente da proteína 2E07 nas raízes, a sua presença provocou um acentuado efeito sobre o desenvolvimento das células gigantes. Como controles desse experimento foram utilizadas plantas não transformadas, e já está bem estabelecido na literatura que nem o promotor CaMV35S ou a expressão da proteína GFP afetam o ciclo de vida do M. incognita (URWIN, 1997). Nós não fomos capazes de detectar nenhuma variação fenotípica externa a nível macroscópico nas plantas de N. tabacum transformadas em relação às plantas controles não trangênicas, sugerindo que a instalação de sítios de alimentação seja mais complexa e que, por exemplo, esse cDNA poderia estar

fazendo parte de uma cascata gênica, e a proteína codificada por este cDNA poderia necessitar de outras proteínas secretadas pelo M. incognita para ser expressa e assim exercer o seu papel no fitoparasitismo. A partir dessas observações decidimos infectar essas plantas transformadas com o gene 2E07 com nematóides em estadio de desenvovimento - J2 que representa a fase infectiva desses fitoparasitas.

A avaliação das plantas infectadas com M. incognita após 08, 16 e 28 dias, revelou diferenças nos sintomas das raízes. Essas diferenças sugerem que a expressão da proteína de secreção nas plantas trangênicas, somado a ação dos fitonematóides provocou um desenvolvimento prematuro dos sintomas do parasitismo. As plantas trangênicas expressando a proteína 2E07 demonstraram um aumento mais acentuado do tamanho das galhas em relação às plantas não transgênicas, principalmente entre 8 e 16 dias após a infecção (DAI). Não foram evidenciadas galhas no período de 8 DAI nas plantas não trangênicas. Nos demais períodos de coleta (16 e 28 dias), as galhas nas raízes também se apresentaram maiores nas plantas transgênicas, reforçando a hipótese do desenvolvimento precoce. Outra análise que suporta essa hipótese é o número de galhas que foi significativamente maior para as plantas transgênicas aos 8 e 16 DAI, entretanto aos 28 DAI nenhuma diferença significativa foi observada no número de galhas, quando comparado com as plantas controle. Estes dados indicam que o processo e formação das galhas aconteceram de maneira mais rápida nas plantas transformadas do que nas plantas controle, corroborando assim com os dados observados nas análises morfológicas.

Ainda, esses resultados sugerem que a proteína 2E07 de glândula dorsal de M. incognita desempenha um papel importante no estabelecimento de uma interação compatível entre o nematóide e a planta hospedeira nos estágio iniciais da formação do sítio de alimentação. A avaliação histológica das raízes revelou uma clara diferença morfológica entre as células gigantes das plantas trangênicas e não trangênicas. As células gigantes dos eventos trangênicos possuíam um maior volume, as invaginações na membrana plasmática eram mais acentuadas quando comparadas as células das plantas controle, que demonstraram um formato celular mais alongado com invaginações pouco evidentes. Outra característica das células gigantes das plantas transformadas eram os numerosos, porém menores vacúolos e estas apresentavam um número maior de células adjacentes em relação às células gigantes controles. Essas diferenças histológicas sugerem que existe uma aceleração no desenvolvimento e no amadurecimento das células gigantes em plantas que ectopicamente expressam a proteína 2E07. Os dados também indicam que a proteína 2E07 deve agir no começo do processo de infecção, estimulando a formação das células gigantes que, por sua

vez, leva a um desenvolvimento mais acelerado do sítio de alimentação desses nematóides. Essa hipótese é suportada pela observação de que foi encontrado um número significativamente maior de J2s eclodidos nas plantas trangênicas após 24h e 48h do que nas plantas controle, sugerindo que o desenvolvimento precoce dos sintomas do parasitismo se reflete também na maior freqüência de eclosão de juvenis dos ovos depositados nas raízes transgênicas. Essa aceleração a nível de eclosão dos ovos coletados nas plantas trangênicas expressando a proteína 2E07, pode ser atribuído a uma aceleração do desenvolvimento da fêmea de M. incognita que se alimenta das células gigantes nas raízes das plantas transformadas.

Foi demonstrado que a expressão heteróloga de proteínas oriundas de patógenos nos tecidos de plantas hospedeiras pode levar a uma repetição de certos sintomas resultantes do parasitismo, indicando assim a importância e, às vezes, a função das proteínas presentes em um parasitoma. O primeiro gene de um nematóide parasita de plantas a ser caracterizado dessa forma, foi o da corismato mutase de M. javanica (DOYLE, 2003), onde a expressão da corismato mutase desse nematóide em raízes de soja levou a um fenótipo de raízes laterais ou abortadas. A Corismato mutase de plantas são enzimas chave na via do chiquimato, estas catalizam a conversão do substrato corismato em prefenato. A corismato (prefenato) é um metabólito precursor na síntese de metabólitos secundários, incluindo fitormônios e compostos de defesa da planta e de três aminoácidos aromáticos, Fenilalanina, Triptofano e Tirosina. Esses compostos derivados da corismato (CDCs) desempenham papéis críticos no crescimento, desenvolvimento e defesa da planta, como também nas interações com outros organismos (SCHMID AND AMRHEIN, 1995; WEAVER AND HERRMAN, 1997 citado por DOYLE, 2003). Um exemplo é o ácido indol-3-acético (IAA), uma auxina, esta é derivada diretamente da corismato ou indiretamente por meio do aminoácido Triptofano (BARTEL, 1997). Outros importantes CDCs incluem o ácido salicílico, um composto utilizado na defesa da planta (DONG 2001; RYALS et al, 1994 citado por DOYLE, 2003), e as fitoalexinas, compostos também utilizados na defesa das plantas, derivados do aminoácido aromático fenilalanina. A secreção da corismato mutase do nematóide no interior do citoplasma da célula vegetal diminuiria a síntese de flavonóides, ácido salicílico, fitoalexinas e auxina da planta. Acredita-se que essa diminuição estaria relacionada com a competição do substrato corismato pela enzima corismato mutase da planta, encontrada nos plastídios, com a liberada no citoplasma pelo nematóide, a qual degradaria o substrato corismato, alterando dessa forma a via do chiquimato. Essa alteração pode resultar na diminuição drástica dos níveis de auxinas plastidial, causando o referido fenótipo.

Outro trabalho de expressão ectópica em plantas foi descrito por Huang e colaboradores (HUANG, 2006b), onde demonstraram que um pequeno peptídeo 16D10, isolado da glândula esofágica dorsal de parasita J2 de M. incognita quando expresso ectopicamente em raízes de A. thaliana, estimulou o crescimento da raiz e a geração de extensas raízes laterais nas plantas devido a um aumento na taxa de divisão celular no meristema radicular. Esse efeito se deve a interação direta entre o peptídeo 16D10 com o domínio específico de dois putativos fatores de transcrição da família SCARECROW em planta (HUANG, 2006b). O papel desses fatores de transcrição no desenvolvimento da célula vegetal permanece desconhecido. Este é o primeiro relato de interação regulatória entre proteínas de plantas e nematóides, sendo um importante ponto a ser explorado na compreensão do modelo de interação planta-nematóide (HUANG, 2006b).

As proteínas 2E07, 11A01 e 13A12 utilizadas neste trabalho não apresentaram identidade ou domínio conservado com qualquer proteína de função conhecida utilizando BLASTn e BLASTp (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) (ALTSCHUL, 1990). Sendo assim, as potenciais funções dessas proteínas permanecem desconhecidas. Entretanto, sabe-se que os cDNAs 2E07, 11A01 e 13A12 são exclusivamente transcritos na glândula dorsal de M. incognita (HUANG, 2003), entre o tempo da penetração nas raízes do hospedeiro e a indução do sitio de alimentação. Este período é compatível com os resultados do experimento de expressão heteróloga da proteína 2E07, que sugerem que a proteína 2E07 age no começo do processo de infecção, estimulando a formação das células gigantes. Esses dados fornecem evidências de que a glândula dorsal dos fitonematóides endoparasitas sedentários é provavelmente o mais importante local responsável pela síntese de efetores essenciais ao parasitismo, relacionados ao controle das celulas hospedeiras (BAUM, 2007). Levando em consideração esses resultados, a hipótese é de que a proteína 2E07 desempenha um papel similar ou possui uma interação com alguma proteína envolvida no processo de ativação do ciclo celular ou no processo de divisão do conteúdo citoplasmático da célula, induzindo a formação do sito de alimentação. Esses dois processos promovem a aceleração da formação do sítio de alimentação visto nos resultados acima citados. Entretanto, a falta de informação sobre a proteína 2E07, que não tem similaridade com nenhuma proteína de função conhecida, nem um motivo ou domínio identificado em sua seqüência de aminoácidos, impede-nos de obter uma hipótese mais sólida sobre a função dessa proteína.

Observou-se que os transcritos 2E07, 11A01 e 13A12 são mais expressos em parasita de segundo estágio (J2), os quais são responsáveis pela penetração e indução do sítio de alimentação. Este dado corrobora com os resultados obtidos na expressão ectópica da proteína

2E07 em plantas de tabaco, que sugere que a proteína 2E07 atua induzindo a formação das células gigantes. Devido à similaridade e possível função parecida das proteínas 11A01 e 13A12, estas podem estar atuando também na indução e formação das células gigantes.

Avanços importantes foram feitos na aplicação biotecnológica do RNA - interferente (RNAi) para o controle de nematóides parasitas de plantas. O silenciamento de um gene que desempenha um papel fundamental no desenvolvimento do nematóide, direta ou indiretamente, pode afetar a progressão da patogênese. Genes que são bons alvos para essa tecnologia tendem a ser específicos de nematóides e / ou podem ter uma conservação na seqüência com ortólogos relacionados a outras espécies para maximizar o espectro de resistência. O efeito do silenciamento gênico tem sido demonstrado em juvenis de segundo estádio de nematóides de cisto e de galhas pela ingestão de dsRNA antes da infecção na planta hospedeira. Na tentativa de se identificar o papel dos transcritos 2E07, 11A01 e 13A12 no parasitismo, utilizou-se o mecanismo de RNAi. Este mecanismo é diferente da superexpressão em fusão com GFP, que permite ver o efeito da proteína de secreção do nematóide nos tecidos da planta hospedeira. O RNAi provoca a degradação do RNA mensageiro que possui seqüência complementar, levando ao silenciamento do gene alvo (BAKHETIA, 2005). Esta técnica é uma ferramenta importante para se analisar a função de genes e para avaliar a sua utilidade como alvos para o desenvolvimento de novos métodos de controle contra esses fitoparasitas. A observação de um fenótipo relacionado ao parasitismo, como desenvolvimento do nematóide ou sua viabilidade após o RNAi é um argumento decisivo para atribuir ao gene um papel importante no processo parasítico desses nematóides (ROSSO, 2009).

Neste trabalho, um dsRNA homólogo a uma região conservada entre os cDNAs 2E07, 11A01 e 13A12 foi utilizado para silenciar os três transcritos. Tal abordagem foi utilizada com o intuito de silenciar os transcritos em conjunto, devido à provável mesma função desempenhada por essas proteínas em conseqüência da alta similaridade entre as seqüências de aminoácidos, evitando assim um possível efeito compensatório entre as proteínas codificadas pelos transcritos.

Foi encontrado que quase 100% dos J2 exibiam o marcador FITC no lúmen do tubo digestivo (ver figura 16), demonstrando que a incubação dos nematóides em 0,25% de resorcinol por 4 h resultou na captação da solução de dsRNA pelo nematóide. Apesar dos tempos de incubação prolongados demonstrarem um efeito deletério sobre os nematóides, 4 h de incubação não demonstrou efeito prejudicial na infectividade e desenvolvimento dos nematóides. Os dados do bioensaio nas raízes de A. thaliana demonstraram que os J2 de M.

incognita submetidos ao tratamento com dsRNA homólogo aos transcritos 2E07, 11A01 e 13A12, após 45 DAI tiveram em média 36% do seu processo infectivo reduzido, segundo o teste de Tukey (p < 0.05). Essa redução da infecção quanto ao número de galhas, massas e ovos por grama de raiz observado nos resultados (ver figura 17), foram provavelmente gerados a partir da redução da formação dos sítios de alimentação nas raízes das plantas, ocasionado pelo silenciamento dos transcritos 2E07, 11A01 e 13A12. Esses resultados indicam que essas proteínas em sinergismo ou não, desempenham um papel importante no processo infectivo do M. incognita.

Vários outros trabalhos utilizando a técnica de soaking para a administração de dsRNAs em fitonematoides têm revelado que o silenciamento de proteinases, quitina sintases, celulases, pode levar à incapacidade ou diminuição da capacidade de desenvolvimento de um nematóide que infecta uma planta. Em um desses trabalhos, o nocaute de genes de proteinases cysteínicas e de uma proteína tipo lectina levou a alteração da proporção sexual favorecendo machos e prejudicou o estabelecimento dos nematóides do cisto nas raízes (URWIN, 2002). Rosso e colaboradores demonstraram que nematóides formadores de galhas (Meloidogyne) submetidos ao soaking com dois genes de glândula subventral, tiveram até 92% dos nematóides silenciados (ROSSO, 2009). Neste ensaio foi utilizado resorcinol como neurotransmissor para estimular a ingestão do dsRNA pelos nematóides. Outro trabalho demonstrou que a ingestão por soaking de dsRNA correspondente ao peptídeo secretório de M. incognita (16D10), que interage com um fator de transcrição da planta, ocasionou uma redução drástica no processo infectivo desse nematóide em plantas de A. thaliana. Sete semanas após a inoculação o número de galhas e de ovos por grama de raiz reduziu em 74- 81% quando comparado com os inóculos feitos com os nematóides não tratados (controle) (HUANG, 2006a). A aplicação de RNAi em nematóides parasitas de plantas utilizando o soaking já demonstrou a participação de diversos genes do parasitoma de fitonematóides. Chen e colaboradores alimentaram juvenis de segundo estádio (J2) de G. rostochiensis com dsRNAs contra uma glucanase (Gr-eng) e uma proteína de secreção dos anfídios deste parasita (gr-ams-1). O tratamento com Gr-eng dsRNA reduziu significativamente a capacidade dos nematóides penetrarem na raiz, indicando que o nematóide precisa desta celulase para romper os tecidos da raiz enquanto penetra na planta. No tratamento com gr- mas-1 dsRNA, os nematóides foram incapazes de localizar a raiz no solo e, por isso, o potencial de penetração dos juvenis foi bastante reduzido.

Juntamente com as recentes publicações acima citadas, os resultados obtidos neste trabalho constituem uma importante contribuição para o entendimento do modelo de

interação, plantas - fitonematóides. Além disso, estabelece o RNAi e a técnica de expressão heteróloga de genes de nematóides em plantas, como valiosas ferramentas na análise funcional de genes de nematóides parasitas de plantas, podendo desta maneira ajudar a identificar candidatos alvos para o controle desses fitonematóides.