3 – Materiais e Métodos
3.1 – Materiais
A quitosana (polymar Ltda, Fortaleza, Brasil) usada neste trabalho apresentou grau de desacetilação em torno de 90% segundo o fabricante. Sua
massa molar (Mv = 2,0 x 105 Da) foi determinada pelo método de viscometria,
utilizando a equação de Mark-Howink-Sakurada (TSAIH et. al.; 1999; TONHI et.
al.; 2002). O fármaco sulfamerazina de sódio (MM= 286,8 gmol-1, Sigma-
Aldrich, St. Louis, USA) foi usado como recebido.
3.2 - Preparação das Membranas
A quitosana em pó foi dissolvida em solução aquosa de ácido acético 0,35 mol/L, sob agitação constante durante 24h, de modo a obter uma solução de 1,5% m/v do polímero. Após este período a solução foi filtrada, sendo este procedimento realizado em duas etapas. Na primeira etapa foi utilizado um filtro com tela de nylon a fim de eliminar resíduos sólidos derivados do processo de
obtenção da quitosana. Na segunda etapa foi utilizado um filtro Millex Millipore®
com diâmetro de poros de 41μm. Um volume de 27 ml da solução de
quitosana foi então adicionado às placas de Petri e estas colocadas em estufa a 50ºC por 24 h para evaporação do solvente. Depois de retiradas da estufa, às membranas formadas, uma solução aquosa de 1,25 mol/L NaOH foi adicionada por 2h para neutralizá-las, sendo estas lavadas em seguidas com água destilada em abundância para remoção dos resíduos de sal. Após o
estiramento e secagem à temperatura ambiente, por 24h, foram obtidas
membranas de quitosana (QUI) com espessura na faixa de 33μm a 43μm
(micrômetro digital,Digi-Derm, Mitutoyo, Brasil).
3.3 - Tratamentos por Plasma
O equipamento utilizado para tratar as membranas de quitosana foi desenvolvido no laboratório de processamento de materiais por plasma da URFN e encontra-se ilustrado na figura 3.1.
Figura 3.1: Desenho esquemático do reator a plasma utilizado para tratamento
O sistema consiste de uma fonte de corrente contínua, sistema de vácuo
(10-3mbar) e transporte de gases. A fonte de tensão contínua possui uma
potência de 1 kW, com voltagem de saída máxima de 900 V e está acoplada capacitivamente ao reator.
O reator consiste de um tubo de vidro de borossilicato, com 180 mm x 300 mm (diâmetros x altura), fechado por dois flanges de aço inox. Pelo flange superior foi inserido os gases de trabalho (eletricamente aterrado). Pelo flange inferior, eletricamente isolado, passa o termopar. Nesse mesmo flange encontra-se acoplado uma bomba mecânica e um manômetro.
A bomba mecânica foi usada para evacuar o sistema a aproximadamente
0,3 x 10-2 mbar. A pressão do reator foi medida por um sensor de membrana
capacitiva, através de um mostrador digital. A temperatura do experimento foi medida utilizando um termopar do tipo alumel-cromel que está localizado dentro do cátodo. O fluxo dos gases foi regulado por um controlador de fluxo e introduzido no reator por orifícios situados no flange superior. A figura 3.2 mostra a foto do reator de plasma utilizado neste trabalho.
Durante o tratamento das membranas de quitosana foram usados os
seguintes gases: Metano (CH4), O2, H2, N2, Ar (White-Martins, Brasil) e alguns
parâmetros foram mantidos constantes como pressão, corrente, fluxo de gás e tempo. Os valores desses parâmetros estão apresentados na tabela 3.1.
Tabela 3.1 – Parâmetros que se mantiveram fixos durante o tratamento
por plasma.
Pressão Corrente Tempo Fluxo de Gás
As membranas de quitosana foram colocadas a uma distância de 5 cm do cátodo para que as mesmas não sofressem modificações devido à temperatura do cátodo (Figura 3.2).
Figura 3.2: Reator de plasma utilizado para modificar as membranas de
quitosana.
3.4 – Técnicas de Caracterização
3.4.1 – Diagnóstico por Espectroscopia de Emissão Ótica
Para investigar as espécies presentes no plasma, o diagnóstico por espectroscopia óptica foi realizado por um sistema composto de um espectrômetro de emissão Acton Spectrapro 2500i com comprimento focal de 500 mm, resolução espectral mínima de 0.05nm. A figura 3.3 mostra o aspecto visual do equipamento.
Figura 3.3: Fotografia do espectrômetro de emissão ótica que inclui o
monocromador, o sensor ótico, o spectrahub e o computador.
Este dispositivo possui três redes de difração com faixas espectrais de comprimento de onda (blaze) diferentes. Neste trabalho foi utilizada a rede de 1800g/mm e uma fibra ótica de 5m de comprimento que interliga a luz proveniente do plasma ao monocromador. Um fotodiodo de silício de 10mm de diâmetro com resposta óptica entre 200-1100nm foi utilizado como detector.
A fibra óptica foi posicionada próximo ao reator, apontando diretamente para a descarga luminescente.
Os espectros de emissão adquiridos foram comparados com os valores encontrados no banco de dados de transição atômica disponível na página eletrônica do NIST (National Institute of Standards and Technology) e em alguns artigos sobre espectroscopia de emissão ótica.
3.4.2 - Microscopia de Força Atômica (MFA)
Amostras tratadas e não tratadas foram analisadas por MFA, buscando-se caracterizar a topografia das mesmas e identificar as mudanças que pudessem ser atribuídas ao tratamento de plasma. Imagens tanto em duas como em três dimensões foram capturadas. Também foram realizadas medidas de rugosidade da superfície das membranas.
As imagens de MFA foram obtidas em um Microscópio da Shimadzu, modelo SPM-9600 (Japão), utilizando modo dinâmico ou intermitente numa
taxa de varredura de 1 Hz. Áreas aleatórias de 5 mμ x 5 mμ foram escaneadas
e analisadas pelo programa SPM Maneger Versão 3.4(Japão) .
3.4.3 – Medidas de Ângulo de Contato
As medidas de ângulo de contato, baseadas na técnica de gota séssil, foram realizadas em um aparato desenvolvido no Labplasma, o qual se baseia na determinação do ângulo de contato através de medidas de diâmetro da base da gota e da altura da mesma.
O aparato usado para medir o ângulo de contato está ilustrado na figura 3.4. Esse é composto de uma base móvel, com movimentos no sentido vertical, uma microcâmera, uma pipeta de volume regulável, e uma fonte de luz difusa.
Figura 3.4: Ilustração do equipamento utilizado para determinação do ângulo
de contato (Macêdo,2008).
As amostras foram colocadas sobre a base plana e em seguida foi depositado uma gota de 10µl dos seguintes líquidos: água destilada, formamida e glicerol, sobre a superfície das membranas. O software utilizado para isolar as imagens foi o Pinnacle Studio Quickstart versão 8 e o software utilizado para calcular o ângulo de contato foi o surftens.
Para este teste foram utilizadas três amostras de cada tratamento e em cada amostra foram feitas cinco medições.
3.4.4 - Ensaio de Absorção de Água
A quantidade de água absorvida pelas membranas foi determinada pela imersão destas em água destilada a temperatura ambiente por 24 h. As membranas de quitosana tratadas e não tratada por plasma foram inicialmente pesadas em uma balança analítica (Mettler Toledo H35AR) com três casas decimais e imersas em água destilada. Acompanhou-se a percentagem de ganho de massa através da pesagem da amostra em diferentes tempos. O ganho percentual de massa M foi calculado através da relação:
100
%
x
m
m
m
s s u−
=
(3.1)Onde mu e ms, representam respectivamente as massas das membranas
úmida e seca.
3.4.5 - Ensaio de Permeação
O fármaco modelo escolhido para ser permeado foi a sulfamerazina de sódio, em virtude de algumas de suas características como solubilidade em água e absorção na região do ultravioleta. As membranas tratadas e não tratadas utilizadas neste experimento foram imersas em água destilada durante 24h antes de serem usadas neste ensaio.
O ensaio de permeação consistiu em colocar a membrana em estudo presa firmemente entre dois compartimentos A e B de uma célula de permeação (Figura 3.5) em formato de U feita de PVC. No compartimento A, colocou-se 230,0 ml de solvente puro (água destilada) e no compartimento B, colocou-se 230,0 ml da solução de fármaco na concentração de 0,017mol/L (1,25g). Ambos os compartimentos foram submetidos à agitação constante. A célula de permeabilidade estava imersa em banhos termoestático a
Figura 3.5 – Esquema da célula de permeação (OLIVEIRA, 2006).
Uma bomba peristáltica (Micronal 332II), foi usada para fazer a conexão entre a célula de permeação e o espectrofotômetro (Genesy 10 UV Scanning, Thermo electron corporation) através de um tubo de silicone obtendo-se assim um sistema de fluxo contínuo. Uma das extremidades do tudo de silicone foi colocada no compartimento A do sistema de permeação onde a alíquota foi retirada, levada até a cubeta de quartzo do espectrofotômetro e continuamente devolvida ao compartimento A. A medida de absorbância foi feita no
comprimento de onda (λ) de 260nm, pois a sulfamerazina de sódio tem sua
Figura 3.6: Ponto máximo de absorção da sulfamerazina de sódio
(TRINDADE, 2004).
3.4.6 - Cálculo da Permeabilidade das Membranas
O valor da permeabilidade das membranas foi calculado utilizando o modelo descrito por Crank, para fluxo de membranas (CRANK, 1975). Neste caso, a quantidade total de substância Q que difunde através da membrana no tempo t é dada pela equação 2.13, mostrada abaixo:
⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ − = D l t l Dc Q 6 2 1 (2.13)
Como a quantidade de fármaco foi determinada por espectroscopia, Q é dada por:
S
Vc
pela lei de Lambert- Beer, A =
ε
.b.c, a concentração é:b
A
c
ε
=
(3.3)Assim, substituindo 3.3 em 3.2 teremos:
bS
VA
Q
ε
=
(3.4)Onde V é o volume da célula de difusão, “A” é a absorbância, S é a área de superfície da membrana, b o caminho óptico da célula do espectrofotômetro,
ε
a absortividade. Igualando a equação 3.4 com a equação 2.13 erearranjando, obtemos:
( )
V
bS
l
c
Vl
bS
Dc
t
A
6
1 1ε
ε
−
=
(3.5)Onde c1 é a concentração da substância difusora na superfície da membrana, D o coeficiente de difusão da membrana, l sua espessura. Tendo em vista que as membranas são relativamente finas, a determinação da concentração do fármaco na superfície da membrana, necessária para a determinação do valor de D, seria muito difícil. Neste caso, optou-se por substituir o cálculo do coeficiente de difusão D pelo cálculo da permeabilidade, utilizando-se para isto a relação existente entre estes dois fatores (equação 2.12). Desta forma, substituindo a equação 2.12 na equação 3.5 obtemos:
( )
V
bS
l
c
t
Vl
bS
PC
t
A
6
1 1ε
−
ε
=
(3.6)Assim o valor da permeabilidade P será obtido através do coeficiente
angular