Culturas de P. brasiliensis (levedura e/ou micélio) foram incubadas na ausência (controle) ou na presença de diferentes concentrações de farnesol para verificação de possíveis alterações na taxa de crescimento, no processo de transição dimórfica, na permeabilidade celular e nas estruturas celulares desse fungo.
3.3.1. Efeito do farnesol no crescimento de P. brasiliensis
Leveduras de P. brasiliensis (2 X 105 cells/mL) foram cultivadas em placas de 96 poços contendo 200 µL final de meio líquido YPD, na ausência ou na presença de diferentes concentrações de farnesol, até atingirem a fase estacionária de crescimento. As células foram mantidas a 37°C sob agitação (150 rpm). A avaliação dos efeitos do farnesol na taxa de crescimento do fungo foi realizada pela verificação diária da densidade óptica (OD) em leitor de ELISA (Elx800) a 630 nm, após vigorosa agitação da placa em vortex. Experimentos similares foram realizados para a fase miceliana de P.
brasiliensis, alterando-se a temperatura de cultivo para 25°C. Os controles utilizados
nesse experimento foram: controle de crescimento (cultura sem farnesol), controle do diluente (cultura com 2% de metanol) e o branco (apenas meio de cultura). A concentração mínima inibitória (CIM) foi definida como sendo aquela que promove 80% de inibição do crescimento quando comparada com o controle (cultura sem farnesol). Todos os ensaios foram realizados em triplicata.
3.3.2. Efeito do farnesol na viabilidade de P. brasiliensis
As análises de viabilidade celular foram realizada utilizando-se o reagente MTT (brometo 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolium; Invitrogen#M6494), o qual avalia a atividade mitocondrial, sendo metabolizado por enzimas desidrogenases e resultando na formação de um produto de coloração roxo denominado formazan (Vistica et al., 1991). Para determinação da concentração mínima letal (CML), leveduras de P. brasiliensis (2 X 105 cells/mL) foram cultivadas em placas de 96 poços contendo 200 µL final de meio líquido YPD, na ausência ou na presença de diferentes concentrações de farnesol. Após 15 dias de incubação a 37°C sob agitação (150 rpm), uma solução de 5 mg/mL de MTT diluído em 0,15M tampão fosfato (PBS) foi adicionada a cada poço da placa para uma concentração final de 0,5 mg/mL. Após 4h de incubação a 37°C, o meio contendo MTT foi parcialmente removido e 100 µL de
DMSO foi adicionado para solubilizar os cristais de formazan formados. Os resultados foram mensurados por verificação da densidade óptica (OD) em leitor de ELISA (Elx800) a 490 nm. A concentração mínima letal (CML) foi definida como sendo aquela que promove 80% de morte celular quando comparada com o controle (cultura sem farnesol). Todos os ensaios foram realizados em triplicata.
O efeito do farnesol na viabilidade celular foi também estimado por contagem de unidades formadoras de colônia (UFC). Leveduras de P. brasiliensis (2 X 105 cells/mL) foram ressupendidas em meio YPD e farnesol foi adicionado para uma concentração final de 5, 10, 25, 50 e 100 µM. Ao controle (sem farnesol) adicionou-se 2% de metanol. Após incubação a 37°C por 4 dias sob agitação (150 rpm), as células foram recuperadas por centrifugação (4000 x g / 5 min), lavadas e plaqueadas em meio BHI (Brain Heart Infusion Agar - Difco) suplementado com 4% de soro de cavalo, cultivando-se por 12 dias. Posteriormente, as UFCs foram contadas. A taxa de sobrevivência do fungo após o tratamento com farnesol foi comparada ao controle (culturas crescidas sem farnesol). A porcentagem de morte celular foi calculada como (1 - N1/N2) x 100, onde N1 é a média do número de colônias da triplicata de cada tratamento com farnesol, e N2 é a média do número de colônia da triplicata do controle (sem farnesol).
3.3.3. Efeito do farnesol sobre o dimorfismo de P. brasiliensis
Os efeitos no processo de transição dimórfica de P. brasiliensis mediados por farnesol também foram avaliados. Para tanto, 2 X 105 cells/mL foram cultivadas em placas de 24 poços contendo 1 mL final de meio líquido YPD, na ausência ou na presença de farnesol. As concentrações de farnesol utilizadas foram a CIM, previamente definida, e concentrações sub-inibitórias, as quais foram adicionadas a inóculos de células tanto da fase de levedura como da fase miceliana de P. brasiliensis cultivados a 25ºC por 24 e 48h, e a 37ºC por 4 dias, respectivamente. Os efeitos do farnesol na morfologia celular foram verificados por microscopia óptica. A porcentagem de células em transição e o tamanho médio dos tubos germinativos foram calculados.
3.3.4. Efeito do farnesol na permeabilidade das células de P. brasiliensis
Visando avaliar o efeito do farnesol na permeabilidade de leveduras de P. brasiliensis, realizou-se o ensaio de coloração com Alaranjado de Acridina (AA) e Brometo de Etídio (BE). Brevemente, 2,5 x 106 cel/mL de P. brasiliensis foram cultivadas na ausência (controle) ou na presença de farnesol (25, 50, 100 e 150 µM). Como controle positivo da metodologia, leveduras de P. brasiliensis e C. albicans foram tratadas com 50 mM de peróxido de hidrogênio. As células foram posteriormente coletadas por centrifugação (4000 x g / 10 min), ressuspendidas em PBS e 20 µL da suspensão de célula foram corados, por 5 min, com uma solução recém preparada de AA (100 µg/mL) / BE (100 µg/mL) na proporção de 1:1. As células foram analizadas por microscopia de fluorescência (Carl Zeiss). Os experimentos foram realizados em triplicate.
3.3.5. Efeito do farnesol nas estruturas citoplasmáticas e na parede celular de P. brasiliensis
A avaliação do efeito do farnesol nas estruturas celulares de P. brasiliensis foi realizada utilizando-se as metodologias de Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV).
MET: Leveduras de P. brasiliensis foram cultivadas a 36°C por 3 dias em meio sem (controle suplementado com 2% de metanol) ou com farnesol (25, 50 e 150 µM). As células foram recuperadas por centrifugação a 4000 x g por 5 min, lavadas quatro vezes com tampão PBS (pH 7,2) e fixadas durante a noite a 4°C (2% glutaraldeído, 2% paraformaldeído e 0,1 M tampão cacodilato de sódio, pH 7,2, com 3% sacarose e 3 mM CaCl2). Após fixação, as células foram coletadas por centrifugação (4000 x g / 5 min), lavadas quatro vezes com 0,1 M tampão cacodilato de sódio (4000 x g / 15 min). As amostras foram pós-fixadas por 1 h (1% tetróxido de ósmio, 0,8% ferrocianeto de potássio em tampão cacodilato de sódio), contrastadas en bloc com 0,5% de acetato de uranila, desidratadas em concentrações crescentes de acetona e emblocadas em resina Spurr. Após ultramicrotomia, os cortes foram contrastados com acetato de uranila/citrato de chumbo, e observados no microscópio eletrônico de transmissão Jeol 1011 a 80 kV.
MEV: Leveduras de P. brasiliensis foram incubadas com diferentes concentrações de farnesol (0, 25 and 50 µM) por 5, 10 e 24 h. Posteriormente, as células foram fixadas
cacodilato de sódio, pH 7,2, com 3% sacarose e 3 mM CaCl2), recuperadas por centrifugação (4000 x g / 5 min), e lavadas quatro vezes com 0,1 M tampão cacodilato de sódio (4000 x g / 15 min). As amostras foram pós-fixadas por 1 h (1% tetróxido de ósmio, 0,8% ferrocianeto de potássio em tampão cacodilato de sódio), e desidratadas em concentrações crescentes de acetona para posterior secagem ao ponto crítico (BAL-TEC CPD-030 – Electron Microscopy Sciences, USA), e revestimento com ouro e paládio (Balzers Union SCD-040 – Electron Microscopy Sciences, USA). Para visualização utilizou-se o microscópio eletrônico JEOL (Tokyo, Japan) JEM 840A.
3.3.6. Avaliação dos efeitos do meio condicionado de C. albicans na morfologia de P. brasiliensis
Levedura de C. albicans (ATCC10231) foram crescidas por cerca de 40 h a 30°C sob agitação (150 rpm). Após esse período a cultura foi centrifugada e o sobrenadante foi coletado, filtrado e usado como meio condicionado (CM). Diferentes concentrações do CM obtido foram adicionadas a inóculos (5x104 cel/mL) de células da fase de levedura de P. brasiliensis submetidas a cultivo na temperatura de 23ºC. Os efeitos do CM na morfologia celular foram verificados por microscopia óptica.
3.3.7. Ensaios preliminares para verificação da identidade química da molécula presente no meio condicionado de C. albicans que inibe a morfogênese de P. brasiliensis
Visando uma avaliação preliminar das propriedades químicas da molécula efetora presente no CM de C. albicans que inibe a morfogênese de P. brasiliensis, o sobrenadante da cultura de C. albicans foi tratado com proteinase K (100 µg/mL / 50°C / O.N.) ou autoclavado por 30 min. Posteriormente, os CMs tratados foram adicionados a culturas de P. brasiliensis que foram submetidas ao processo de transição dimórfica, como descrito anteriormente.
3.3.8. Análise estatística dos resultados
As análises estatísticas foram feitas com o auxílio do programa de computador “Mynova”, versão 1.3 (S. Brooks, Copyright 1993). Os dados estão apresentados como médias +/- SEM (erro padrão da média). Para comparações entre dois dados (condição experimental X condição controle) foi utilizado o teste-t de Student, sendo considerados os valores de P < 0,05 como significativamente diferentes.
3.4. Análise dos efeitos de propranolol na formação de biofilme